Nature三连，非编码DNA成癌症研究新热点

RNA剪接在基因表达中占据核心位置，其主要参与基因转录过程中，内含子切除、外显子拼接的一步。正确的RNA剪接会形成正确的mRNA，反之，则会使原本序列中新增一段非编码DNA序列，生成错误的mRNA，进而形成错误的蛋白质，导致疾病。

最新的研究发现，RNA的异常剪接与U2 snRNP的剪接因子SF3B1的突变相关，而SF3B1是最常被检测到的突变的RNA剪接因子。据报道，在髓系白血病、淋巴系白血病和实体瘤中，SF3B1在特定残基位点处反复发生错误突变。RNA剪接过程主要由U1-U6完成，其中U1主要功能是识别5’剪接位点；U2主要功能是识别3’剪接位点，突变的SF3B1则导致异常3’剪接位点被识别。

[1] Daichi Inoue et al. Spliceosomal disruption of the non-canonical BAF complex in cancer, Nature.

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-019-1646-9

第一篇来自于Omar Abdel-Wahab和Robert K. Bradley的合作研究，利用全癌剪接分析和CRISPR技术，鉴定得出不同的SF3B1突变都会抑制BRD9，BRD9是非典型BAF（ncBAF）染色体重塑复合物的核心组分，是一种重要的抑癌蛋白。突变的SF3B1识别BRD9基因内一个异常的内含子分支点，从而诱导内源性逆转录病毒元件的毒性外显子的形成，致BRD9的mRNA发生降解。BRD9的缺失则会导致CTCF相关基因位点上ncBAF的丢失，促进黑色素瘤的发生，故在SF3B1突变细胞中纠正BRD9的错误剪切能够有效抑制肿瘤生长。

研究人员对SF3B1突变细胞系和多数慢性淋巴系白血病、骨髓增生异常综合征和UVM患者样本的错误剪接事件进行了分析，然后利用CRISPR阳性富集筛选系统进行功能分析。结果显示：BRD9的缺失促进细胞转化，且在所有携带SF3B1突变的癌症患者的BRD9基因中，均存在RNA的错误剪接现象；对该基因进行敲除后，人类UVM、皮肤黑色素瘤、胰腺癌细胞就会生长；SF3B1突变导致BRD9内含子序列的外显子化，即毒性外显子形成，该变化可介导RNA降解。

SF3B1突变导致BRD9毒性外显子形成

利用CRISPR-Cas9技术对BRD9毒性外显子进行修正后，该外显子中的夹杂物得到删除修正。

基因编辑后的BRD9毒性夹杂物丢失

BRD9与GLTSCR1是一部分ncBAF的组成物，SF3B1突变会使BRD9基因缺失。在UVM中，BRD9的丢失会优先影响参与凋亡与细胞生长、粘附和迁移的基因。BRD9降解后，BRD9和BRG1、GLTSCR1之间的相互作用力也随之消失，但BRG1和BAF155的相互作用仍保持完整，说明SF3B1突变体特异性破坏了ncBAF。

SF3B1突变细胞中的BRD9剪接影响肿瘤生长

那么BRD9缺失后，基因表达会出现什么变化呢？研究者对具有启动子的基因进行了研究，结果显示：在这些启动子中，BRD9可以跟ncBAF进行结合，且能够在突变型与野生型SF3B1的UVM患者中进行差异表达。ncBAF结合力的丧失与基因表达的提升和抑制有关，足以表明ncBAF既具有激活作用又具有抑制作用。

BRD9是黑色素瘤的可治疗靶向肿瘤抑制因子

1 

将黑色素瘤细胞系移植于SCID小鼠（Jackson Laboratories）体内，将慢性淋巴细胞白血病患者的细胞系移植于NSG小鼠（Jackson Laboratories）体内，每天对小鼠进行严格的疾病或发病迹象监测。在小鼠体内发现肿瘤体积超过1cm3，小鼠出现明显的体重减轻、皮肤病、出血以及感染现象。

使用优化的CRISPR设计工具（http://crispr.mit.edu）选择出靶向BRD9转录起始位点的guide RNA序列，用同源重组法将其克隆至px458-GFP载体中。由于该序列含有HA标签，故其与HA标签上游的BRD9 5'UTR具有同源性。使用Lonza Nucleofector V试剂盒将靶向构建体转染至K562 SF3B1K700E细胞和MEL270细胞中，随后进行细胞分选。将SF3B1 cDNA在K562细胞中进行过表达，通过RNeasy Mini or Micro kit (Qiagen)分离得出总RNA，再使用uperScript VILO cDNA synthesis kit (Life Technologies)将其转录成cDNA，稀释后使用SYBR Green PCR Master Mix进行定量RT-PCR分析，上述分析在Applied Biosystems QuantStudio 6 Flex循环仪 (ThermoFisher Scientific)上进行。
 

2

以上所有细胞培养基均含青霉素和链霉素
 

3

将一抗用5％ BSA（Sigma-Aldrich）稀释，取2–5μg抗体与protein A/G PLUS Agarose于4°C下孵育3小时（Santa Cruz Biotechnology），通过Pierce IP裂解缓冲（Thermo Fisher Scientific）洗涤3次后，用Pierce Lane Marker Reducing Sample Buffer（Thermo Fisher Scientific）洗脱免疫沉淀的蛋白，然后上样至4–12％Bis-Tris NuPAGE Gels（Life Technologies）。
 

4

抗体：BRG1、BRD9 （Abcam）

用空载体对MEL270细胞进行转导，用强力霉素或DMSO处理野生型SF3B1 cDNA和SF3B1K700E cDNA。
 

5

将用空载体或带Flag标签的BRD9转导的K562细胞于含10％ FCS的RPMI中培养，随后进行质谱分析。细胞用1％不含甲醇的甲醛（Sigma）固定8分钟，并用0.125 M甘氨酸（Sigma）进行淬灭。通过添加裂解缓冲液分离染色质，然后用Dounce匀浆器破碎。对裂解液进行超声处理后，将DNA剪切至300–500 bp。通过用RNase、蛋白酶K和加热处理染色质等方式对其进行反向交联，然后用乙醇沉淀获取gDNA。将球粒重悬，并将所得的gDNA在NanoDrop分光光度计上进行定量。用Protein G（Invitrogen）预清洗等分的染色质，并对所需蛋白进行免疫沉淀。洗涤蛋白质复合物，去除免疫沉淀物和蛋白质消化物。将蛋白质消化物与磁珠分离，使用C18离心柱（Harvard Apparatus）进行纯化。使用SpeedVac将肽段进行真空干燥。在Thermo Scientific Q Exactive Orbitrap质谱仪上，采用Proxeon Easy-nLC II HPLC（Thermo Scientific）和Proxeon nanospray source，通过液相色谱和串联质谱法对消化的肽段进行分析。

6

用强力霉素诱导的LT3GEPIR慢病毒载体T3G-GFP-mirE-PGK-Puro-IRES-rtTA334转导细胞， 表达针对BRD9的shRNA或针对雷尼拉的非靶向shRNA。加入强力霉素（Sigma Aldrich）诱导shRNA。 
 

7

用非靶向对照siRNA（Dharmacon），针对U2AF1的siRNA库（Dharmacon）或针对U2AF2的siRNA库转染K562细胞 （Dharmacon），使用Lonza的Nucleofector II设备和Cell Line Nucleofector Kit V对其进行转染和RNA、蛋白质的提取。使用1μg RNA和Superscript III第一链合成系统（Thermo Fisher）生成cDNA。

为分析sgRNA对BRD9的作用，先用LentiCas9-Blast（Addgene）转导细胞系，然后将其单细胞分选到96孔板中。将gRNA序列克隆至iLenti-guide-GFP载体中，对表达Cas9的细胞进行慢病毒转导，发现sgRNA的表达与GFP的表达有关。然后使用BD LSRFortessa测量表达GFP的细胞的百分比，计算GFP的阳性率。同样，为了分析cDNA、HTRA1 cDNA或shRNA对BRD9或HTRA1的作用，分别将pMIGII-主链质粒（cDNA）和LT3GEPIR质粒（shRNA）导入黑素瘤细胞后，计算GFP阳性率。
 

8

用LentiCas9-Blast（Addgene）转导Ba/F3细胞，并将单细胞分选到96孔板中。在这些克隆中，使用了具有强Cas9表达的单克隆。SF3B1突变细胞中NMD靶标的sgRNA文库被扩增并转导为慢病毒。该文库包含针对每个靶基因的4个sgRNA，针对Pten的100个对照sgRNA和阳性对照sgRNA。用293FT细胞产生的携带慢病毒的sgRNA文库转导Ba/F3细胞，并在含IL-3的培养基中进行嘌呤霉素选择。洗出IL-3，并在IL-3耗尽后收集了存活的细胞。裂解细胞沉淀，提取gDNA（Qiagen），并通过Qubit（Thermo Scientific）进行定量。使用Q5高保真聚合酶（NEB）对gDNA进行PCR扩增，添加Illumina衔接子和多重条形码。通过Qubit和Bioanalyzer（Agilent）对扩增子进行定量，并在Illumina HiSeq 2500上进行测序。对每个gRNA进行计数，并在细胞因子耗竭后第0天到第7天比较每个sgRNA数量。对于探针水平的分析，我们拟合了负二项式广义对数线性模型，并在Bioconductor edgeR软件包中使用glmFit和glmLRT进行了likelihood ratio测试。对于基因水平的分析，在edgeR36–38中进行CAMERA测试，使用Benjamini-Hochberg方法计算FDR值。

用靶向BRD9毒物外显子5'末端的iLenti-guide-Puro载体转导表达Cas9的MEL202和MEL270细胞。在选择嘌呤霉素后，使用BD FACSAria III细胞分选仪将单细胞分选到96孔板中。通过PCR扩增，然后进行Sanger测序，确认突变是由Cas9和sgRNA引起。
 

9

由MEL202和MEL270细胞制备单细胞悬液，在有或没有CRISPR介导的情况下，将来自细胞系的3000个细胞一式三份置于预处理的平板中，10天后对菌落进行计数。用3.7％多聚甲醛固定菌落5分钟，并在室温下于0.05％结晶紫溶液中染色30分钟，然后用PBS和自来水洗涤。
 

10

将细胞以每孔1000个细胞的密度接种在白色平孔96孔板中，每隔24小时使用Cell Titer Glo（Promega）进行发光读数。
 

11

将Flag–SF3B1（WT）或Flag–SF3B1（K700E）转导至SF3B1野生型MEL270和T47D细胞中，用新霉素进行筛选（Thermo Fisher Scientific），随后用强力霉素（Sigma）处理所选细胞。使用Agilent QuikChange II site-directed mutagenesis kit对BRD9进行诱变，转染前，将细胞接种至24孔板中，转染后收集细胞，使用Qiagen RNeasy mini kit提取RNA，通过RT-PCR分析BRD9基因特性。

[2] Hiromichi Suzuki et al. Recurrent non-coding U1-snRNA mutations drive cryptic splicing in Shh medulloblastoma, Nature.

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-019-1650-0.

第二篇，研究者发现近一半的Sonic hedgehog髓母细胞瘤的UI剪接因子的snRNA会产生高频热点突变，患病人群主要为成年人与青少年，且该突变不存在于其他髓母细胞瘤亚种中。突变主要发生在5'剪接位点结合区域，且snRNA突变型肿瘤会使RNA剪接发生错误，造成PTCH1蛋白失活，从而激活了GLI2，CCND2两种癌蛋白，其中PTCH1为一种抑癌因子。这项研究发现了髓母细胞瘤的治疗新靶点，并构成了癌症中非蛋白质编码基因的高度复发性和组织特异性突变。

[3] Shimin Shuai et al. The U1 spliceosomal RNA is recurrently mutated in multiple cancers, Nature.

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-019-1651-z

第三篇，研究者收集了多种癌症样本，经分析发现在U1 snRNA的高频热点突变的第3个碱基上发生A>C的体细胞突变，从而使U1和5’剪接位点间的偏好性发生改变，原本的A-U配对变成了C-G配对，RNA剪接发生变化。在临床上，A> C突变与肝细胞癌（HCC）的酒精滥用和慢性淋巴细胞性白血病（CLL）的侵袭性IGHV亚型相关。该研究证明了剪接体RNA中最早的非编码驱动程序之一，揭示了癌症中异常剪接新机制，有望成为癌症新的治疗靶标。

以上三篇同期发表在《Nature》的文章揭示了 RNA的错误剪接导致患者体内的抑癌因子失活，同时却激活了原癌基因，可谓是癌症“好助手”。这些异常剪接研究机制会在癌症治疗新靶标的发现中发挥重要意义。

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