单细胞测序/NGS共同抗“疫”

2013年发表在Nature上的Isolation and characterization of a bat SARS-like coronavirus that uses the ACE2 receptor一文，其实验流程图简述如下：

收集咽拭子和粪便拭子或新鲜的粪便样品。所有PCR均使用一步式RT–PCR试剂盒进行。靶向RdRP基因高度保守区域的引物可用于检测所有α-冠状病毒和β-冠状病毒。根据SARS-CoV和SL-CoV的所有可用基因组序列设计简并引物，并用于扩增S基因的RBD序列或全长基因组序列。简并引物用于扩增ACE2基因。聚合酶链反应将产物凝胶纯化并克隆到质粒pGEM-T Easy Vector中。对至少四个独立的克隆进行测序以获得共有序列。将PCR阳性粪便样品（在200ml缓冲液中）在3,000–12,000g中进行梯度离心，并在DMEM中将上清液以1:10稀释，然后添加到Vero E6细胞中。在37 ℃孵育1小时后，移走接种物，并用含2％ FCS的新鲜DMEM代替。将细胞在37℃下孵育，每天检查其细胞病变作用。将不同来源的细胞系培养在24孔板的盖玻片上，并以10的倍数感染接种新型SL-CoV。在感染后24小时，使用anti-SL-CoV Rp3的兔抗体检测到病毒复制核衣壳蛋白。

Vero E6细胞单层维持在补充有10％ FCS的DMEM中。将PCR阳性样品（在200 ml缓冲液中）以3,000–12,000g梯度离心，然后将上清液在DMEM中按1:10稀释，然后添加到Vero E6细胞中。在37℃下孵育1小时后，移出接种物，并用含2％ FCS的全新DMEM代替。将细胞在37℃下孵育3天，每天检查其细胞病变作用。所有组织培养基（青霉素200 IU / ml，链霉素0.2 mg / ml，两性霉素0.5 mg / ml）均包括双剂量三联抗生素青霉素/链霉素/两性霉素。对每个样品进行三个盲传。每次传代后，使用靶向RdRP或S基因的引物通过RT-PCR检查培养上清液和细胞沉淀中是否存在病毒。收集上清液（10 ml）中的病毒颗粒，并使用0.1％甲醛固定4 h，然后在80,000 g下通过20％蔗糖缓冲液（5 ml）超离心90分钟进行浓缩。将沉淀的病毒颗粒悬浮在100 ml PBS中，用2％磷钨酸（pH 7.0）染色，并在200 kV下使用Tecnai透射电子显微镜（FEI）进行检查。

此外，其他已报道文献中病毒分离纯化的通用方法皆为密度梯度超速离心后稀释接种培养，电镜镜检分离。

美国疾病控制与预防中心呼吸病毒科在2020年1月发布了一份采用Real-Time RT-PCR检测2019-新型冠状病毒（已改名为严重急性呼吸综合征冠状病毒SARS-CoV-2）的实验方案，作为美国本土疑似病例最终确认的检测手段。更多详细内容详见：

https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/lab/rt-pcr-detection-instructions.html

CDC采用了QIAGEN和Roche的RNA提取试剂盒

CDC发布SARS-CoV-2核酸提取纯化步骤

CDC发布SARS-CoV-2核酸扩增步骤

同时，中国国家疾控中心病毒病预防控制所也发布了新型冠状病毒核酸检测引物和探针序列，该引物和探针可用于新型冠状病毒的临床检测和病例确诊。

SARS-CoV-2核酸检测引物和探针序列

关于病毒核酸物质的提取、纯化与扩增，小优之前已有文章介绍，详见：抗击疫情 | 优宁维携手QIAGEN助力科研应对2019-nCoV

2020年1月24日发表在Lancet的Clinical features of patients infected with 2019 novel coronavirus in Wuhan, China一文中指出，当地疾病预防控制中心收集了患者呼吸道、血液和粪便标本，通过NGS和实时RT-PCR方法检测到呼吸道标本中存在2019-nCoV。作者检测了患者细胞因子的表达水平，发现细胞因子风暴与2019-nCoV导致的疾病严重程度有关。

关于细胞因子风暴，小优之前已有详细的文献解读文章，详见“新型冠状病毒与细胞因子风暴”。

2020年1月24日发表在bioRxiv预印本的Single-cell RNA expression profiling of ACE2, the putative receptor of Wuhan 2019-nCov一文，通过单细胞测序分析，发现ACE2受体的表达主要集中在肺内一小群II型肺泡上皮细胞(AT2)上，这群对病毒易感的AT2细胞占所有AT2细胞数量的1%左右。这些AT2细胞不仅表达病毒受体，还高表达其它二十多个与病毒复制和传播密切相关的基因，说明其很可能正是冠状病毒感染的靶细胞。此外，基于个体人群的分析指向男性可能比女性表达更高水平的ACE2，而亚裔有可能比其它人种表达更高水平的ACE2，但这一推测尚有待更大规模人群数据来验证。

众所周知，受体的表达和分布决定了病毒感染的途径，而感染的途径对于理解发病机理和设计治疗策略具有重要意义。有研究表明ACE2主要在I型和II型肺泡上皮细胞(AT1和AT2)中表达。因此，研究者对在线数据库中的8名正常的肺移植捐献者的肺组织进行了单细胞RNA测序技术。结果分析了43134个细胞，并进行了聚类分析，又针对每个个体，基于标记基因而划分为8-11个不同的细胞簇。

人肺部细胞单细胞RNA-Seq分群分析

之后，作者分析了ACE2在每个个体中的细胞类型特异性表达模式。对于所有供体，ACE2在所有人肺细胞中的表达率为0.64%，大多数ACE2表达细胞（平均83%）是AT2细胞 (平均1.4±0.4%的AT2细胞表达ACE2)。其他表达ACE2的细胞类型包括AT1细胞、气道上皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞和巨噬细胞。然而，它们表达ACE2的细胞比率较低，且在个体间存在差异。

ACE2和特定细胞类型特异性标记基因表达示意图

2020年1月24日发表在bioRxiv预印本的Complete genome characterisation of a novel coronavirus associated with severe human respiratory disease in Wuhan, China一文，收集了患者的支气管肺泡灌洗液，采用宏基因组RNA测序鉴定出一种新型RNA病毒（已命名为SARS-CoV-2）。对完整病毒基因组（29,903个核苷酸，10个基因）进行检测分析，并将SARS-CoV-2基因组提交至NCBI GeneBank数据库。SARS-CoV-2与2003年SARS-CoV病毒的核苷酸相似性高达89.1%。

SARS-CoV-2主要结构蛋白编码基因的位置及TRS信息

SARS-CoV-2主要结构蛋白编码基因的位置

关于病毒基因组信息测序，详见：抗击疫情 | 优宁维携手QIAGEN助力科研应对2019-nCoV。

关于病毒的分离纯化，小优这里整理了三种产品使用实验方案：

• 分离纯化试剂盒

• 密度梯度离心介质---Percoll

密度梯度离心是病毒纯化的常用方法。Percoll是病毒纯化密度梯度离心中常用的试剂。Percoll是具有PVP包被的硅溶胶，溶液的密度为1.13g/ml，可以根据需要配成连续或者非连续密度梯度用于密度梯度离心。和传统的蔗糖和CsCl相比，Percoll具有低内毒素水平，无菌试剂，无毒性，低渗透压和低粘度等特点，更适合于病毒和细胞纯化。有文献报道，Percoll的离子强度和渗透压更适合于纯化脆弱的生物结构，比使用蔗糖和CsCl可以得到更多的有感染性的病毒颗粒，并且Percoll不会干扰下游的电子显微的观察研究，DNA和蛋白的分析，电泳和免疫沉淀或者细胞嗜斑形成等生物学实验*。

*Hakan Pertoft. Fractionation of cells and subcellular particles with Percoll. J. Biochem. Biophys. Methods 44 (2000) 1–30

• 病毒纯化柱/纯化填料

中空纤维膜与Capto Core 400/700联合使用，详情可见：蛋白纯化专题#27：Capto Core新型填料介绍--病毒纯化强推。

A.病毒澄清、除杂、浓缩---中空纤维膜

中空纤维膜由于具有独特的开放式流道，温和的低剪切力操作可以有效防止病毒表面糖蛋白的脱落和蛋白的聚集，特别有利于保护大分子病毒的完整性，防止病毒颗粒聚集的同时有助于杂蛋白的透过和去除，目前已经广泛的应用于各种病毒或者疫苗的微滤澄清和超滤浓缩/换液等步骤，比如狂犬病毒，流感病毒，HPV，VLP等等。

B.病毒纯化---Capto Core 400/700

Capto Core 400和Capto Core 700是GE的新款设计用于病毒纯化的填料。填料基于新型的核心微球技术及复合模式，每一个微球都有核心和壳层双层结构。壳层会阻止大分子病毒样品进入微球，而小蛋白和杂质会进入内核连接在核心疏水和带有正电荷的辛胺配基上。基于新型的核心微球技术，Capto Core在提供高纯度的同时也降低了成本，能有效去除HCP和DNA。