新冠病毒防治？——中和抗体大有所为

​近几年我们发现，病毒的变异越来越快，病毒疫情的爆发周期也在逐渐缩短。因此，加大针对病毒的相关研究，防患于未然，也会得到越来越多人的重视。在这次新冠肺炎疫情中，临床一线发现，康复者身上带有抗体的血浆，可以起到治疗效果。据相关研究报道，新冠肺炎康复者的血浆中已检出高效价病毒中和抗体，灭活处理后，可制备出新冠病毒特免血浆制品，患者接受治疗12-24小时后，实验室检测主要炎症指标明显下降，临床体征和症状明显好转。

虽然利用康复者血浆治疗已经纳入新冠病毒肺炎诊疗方案，但是仍然面临如康复期患者血浆来源有限，很难评估和鉴定这些不同康复者来源的中和抗体的效果，血浆里的其它细胞因子等物质存在潜在风险等诸多挑战。和使用康复者血浆相比，使用治疗性中和抗体是更稳定和安全的治疗方法。治疗性中和抗体的获得，可以实现低成本大规模的生产，具有质量稳定可靠，免疫原性极低，安全性更好的特点。因此，治疗性中和抗体将会在病毒的预防，诊断和治疗中发挥巨大的作用。

今天小优就通过解读一篇中和抗体的文献，来一起看一下中和抗体的获得和检测实验方法。

在确认病毒的结合位点后，有关病毒的中和抗体不断被研究和发现。很多研究表明，使用中和抗体进行免疫治疗是一个对抗病毒感染进行预防和治疗的很有力的工具。例如，一个有效的治疗性MAb，palivizumab，现在在临床被用于预防和治疗respiratory syncytial virus。也有一些MAbs被用于对抗流感病毒。这些研究表明，治疗性的中和抗体可能是一个预防和治疗病毒疫情的有前景的方式。

中和抗体的分离可以采用多种方式。例如，抗体文库的噬菌体或者酵母展示技术；实验动物的免疫方法；或者直接从病毒治愈者中分离。

应天雷教授发表的Exceptionally Potent Neutralization of Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus by Human Monoclonal Antibodies一文，指出从天然抗体库中筛选出了m336抗体，可作用于MERS病毒S蛋白的受体结合结构域（RBD）。实验表明，m336具有很强的中和活性，可以作为一个有力的MERS感染预防和治疗的方法。

小优仔细研读了应教授的此篇文章后，实验过程整理如下：

从人噬菌体展示抗体库中筛选出对于MERS-CoV RBD的高亲和性的Fabs，主要过程包括：抗体文库构建、Panning筛选、噬菌体ELISA检测。

抗体噬菌体展示技术在Antibody Phage Display: Technique and Applications文章中有详细介绍。抗体噬菌体展示技术（APD）基于噬菌体的基因工程技术和重复的抗原指导筛选和噬菌体扩增。这个技术可用于体外筛选特异性的mAbs，促进了科研和临床诊断中重组试剂的生产和用于人类治疗药物的研发。

APD技术首先需要抗体文库的准备，然后把可变区重链（VH）和可变区轻链（VL）PCR产物连接在噬菌体展示载体上，最后进行MAbs克隆的检测。技术的关键在于从细胞中（例如单个核细胞）得到高质量的RNA，然后反转录成cDNA，用于抗体的VH链和VL链的PCR扩增。VH和VL PCR产物连接到噬菌体展示载体上（例如phagemid pComb3X），这个噬菌体载体经过改造，可以表达VH和VL作为scFv融合在大肠杆菌丝状噬菌体M13的pIII次要外壳蛋白上。由此得到一个噬菌体抗体文库，在噬菌体的表面会表达我们构建的抗体。

抗体文库构建成功后，接下来需要进行筛选。文库筛选通过一种叫做panning的技术，检测表达在噬菌体表面的抗体和抗原的结合。循环多次的panning可以筛选出与抗原结合的噬菌体株，过程包括多次循环的与抗原结合，清洗，洗脱和噬菌体的扩增。每循环一次，和抗原结合的特异的噬菌体株被不断筛选出来，在3-4个循环之后，就可以得到高特异性的和抗原有结合的噬菌体株。

在多次的panning之后筛选出噬菌体株之后，需要通过噬菌体ELISA进行检测。主要实验过程是先把待检测的病毒抗原蛋白包被在ELISA板子上，然后加入噬菌体样本，用Anti-M13-HRP抗体进行ELISA检测。

本文的作者使用了40个志愿者的单个核细胞（PBMC）的cDNA作为模板，制备抗体文库。文库使用MERS-Cov RBD（residues 360 to 601）连接的磁珠作为抗原进行panning。构建病毒的受体结合蛋白或者蛋白片段时，可以在蛋白的N端或者C端加上 His/GST/MBP/Strep 标签，然后使用GE的标签蛋白预装柱或者填料进行蛋白纯化。可以使用GE的NHS琼脂糖珠或磁珠结合病毒蛋白。扩增的文库包括10的12次方噬菌体分别在第1,2,3,4轮panning中与5,3,3,1ug的RBD进行孵育，在第三轮和第四轮panning中与RBD结合的噬菌体株进一步进行噬菌体ELISA。

 作者通过ELISA和Biacore对筛选出的Fabs进行检测，发现m336，m337和m338具有较高的结合性。

为了得到全长的IgG1抗体，作者将m336，m337和m338的VH和VL进行扩增，克隆到pDR12载体上。然后对Fabs和IgG1进行表达和纯化。抗体片段的纯化可以使用GE的Protein L；抗体纯化可以使用GE的Hitrap ProteinA或Hitrap ProteinG预装柱或填料。作者对Fabs和IgG1s使用Biacore进行亲和力检测，进一步确认了m336，m337和m338对MERS-CoV RBD具有较高的亲和力。

作者首先使用了MERS-Cov假病毒进行实验。具体实验方法为：MERS假病毒的制作是通过把pNL4-3.luc.RE质粒 (encoding Env-defective, luciferase-expressing HIV-1) and和pcDNA3.1 -MERS-CoV-S 质粒共转染至293T细胞中进行表达。DPP4表达的Huh-7细胞在m336，m337和m338抗体存在或者不存在的情况下用MERS-CoV假病毒进行感染。培养12小时后换液，再培养72小时。细胞裂解后进行荧光检测。结果表明，3个抗体都具有较好的中和活性，50% inhibitory concentration (IC50)为0.005 to 0.017 g/ml。

然后作者使用MERS-CoV病毒进行中和实验。具体实验方法为：m336，m337和m338抗体和MERS-CoV加入到培养基中，37度混合2h后，加入到Vero细胞中进行细胞感染。在37度孵育3天后，进行细胞病变效应检测。结果表明m336具有较高的中和活性。

GE提供专一稳定的高分辨率和高载量的proteinA和ProteinG预装柱和填料助力于抗体纯化。

Biacore技术利用SPR原理，可以高灵敏度的检测蛋白与蛋白，蛋白与抗体，蛋白与核酸或者其他分子间的相互作用，提供动力学，亲和力，特异性等检测信息，频繁的应用于基础研究和药物筛选实验中。

①Wenhui Li,et al.Angiotensin-converting enzyme 2 is a functional receptor for the SARS coronavirus. NATURE,2003,VOL 426.

②V. Stalin Raj, et al. Dipeptidyl peptidase 4 is a functional receptor for the emerging human coronavirus-EMC. NATURE,2013, VOL 495.

③Liwei Jiang, et al. Potent Neutralization of MERS-CoV by Human Neutralizing Monoclonal Antibodies to the Viral Spike Glycoprotein. Science Translational Medicine,2014,Vol 6.

④Tianlei Ying, et al. Exceptionally Potent Neutralization of Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus by Human Monoclonal Antibodies. Journal of Virology,2014, Volume 88.

⑤Antibody Phage Display: Technique and Applications. J Invest Dermatol. 2014 February ; 134(2).