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“抗体选不对,实验两行泪”!手把手教你精准选择WB实验抗体

6661 人阅读发布时间:2024-06-14 09:52

今天是《抗体选择超全指南》专题的第三期,前两期我们介绍了《抗体选择超全指南之抗体小知识》和抗体选择基本原则《一文读懂抗体选择,建议收藏!》,今天就WB实验举例手把手教你选择合适的抗体,咱们开始吧~

 

案例一:WB检测原代人胰岛细胞siRNA敲降FKBP5后pAKTser473蛋白的表达情况

1、选择一抗

该一抗需满足三要素:

目的蛋白:内源性的磷酸化AKT(Ser473)
检测样本种属:人
实验方法:WB

 
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依照我们在《一文读懂抗体选择,建议收藏!》中介绍的基本原则,以上这个抗体#4060无论是检测的靶标、实验方法、反应种属以及灵敏度都满足需求,并且这个抗体已发表文献10478篇,是非常经典热销的产品,所以就选择它了。

需注意的是,在检测磷酸化蛋白时,总蛋白和内参都需要做,因磷酸化水平的变化需要用磷酸化蛋白与总蛋白比值变化来判定,所以要同时购买AKT总蛋白的抗体,同理经过筛选后我们选择了#9272,以及内参beta-actin #abs119600

一抗选择小心机:一抗尽量选择同一来源的,二抗可通用哦~

 

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2、选择二抗

普通的WB实验,二抗可选择普通形式的,即名称包含anti-IgG(H+L)的,(还记得H+L代表什么意思吗?不记得的话可以去《抗体选择超全指南之抗体小知识》补课哦),这类产品适用性广且价格便宜。因#111-035-144稀释比例非常高,做WB最高可达1:200000,性价比高,所以优先选择了它。

 

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3、选择结果

结果出炉,就是这么简单,你get到了吗?

选择目标 货号 来源 产品名称
磷酸化一抗 4060 Rabbit Phospho-Akt(Ser473)(D9E)XP® Rabbit mAb
总蛋白一抗 9272 Rabbit Akt Antibody
内参 abs119600 Rabbit Rabbit anti-β-Actin Polyclonal Antibody
二抗 111-035-003 Goat Peroxidase-AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)

 

案例二:荧光WB如何选择二抗

有小伙伴实验室做的是近红外荧光WB,那么应该如何选择抗体呢?其实荧光WB一抗的选择和普通WB没有区别,只是不再使用传统的HRP标记的二抗,而是使用近红外染料标记的二抗结合特异性一抗,无需使用胶片和显影液。

Alexa Fluor®680和Alexa Fluor®790都是近红外染料,除了这两种染料标记的二抗之外,很多厂家也推出其他的近红外染料标记二抗,若说明书写明适配了您的仪器平台,那么根据需求选择即可,以下是部分热卖的近红外染料标记二抗:

货号 种属来源/对应一抗种属 二抗形式 特异性 偶联标记 可消除交叉反应 规格
115-655-146 Goat Anti-Mouse Whole IgG IgG (H+L) Alexa Fluor® 790 Human, Bovine, Horse, Rabbit, Swine Serum Proteins 0.5 mg
115-625-146 Goat Anti-Mouse Whole IgG IgG (H+L) Alexa Fluor® 680 Human, Bovine, Horse, Rabbit, Swine Serum Proteins 0.5 mg
111-655-144 Goat Anti-Rabbit  Whole IgG IgG (H+L) Alexa Fluor® 790 Human, Mouse, Rat Serum Proteins 0.5 mg
111-625-144 Goat Anti-Rabbit  Whole IgG IgG (H+L) Alexa Fluor® 680 Human, Mouse, Rat Serum Proteins 0.5 mg

 

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Alexa Fluor ® 790 
Alexa Fluor ® 680 

 

案例三:IP后的WB如何选择抗体

如果IP和WB一抗来源(Host/Source)相同,IP后沉淀含有目的蛋白和IP抗体,在高温金属浴及还原剂的作用下,IP抗体发生发生变性,断裂为游离的重链(~50kDa)和轻链(~25kDa) 。后续做WB若使用前述的常规Anti-IgG(H+L)的酶标二抗,会同时识别原先的IP抗体和WB抗体,导致膜上至少出现三条不同的带,那么如何解决这个问题呢?

 

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解决方案一: WB一抗与IP一抗选择不同种属来源,此时选择普通二抗即可。

解决方案二: WB选用HRP偶联一抗,无需二抗。

解决方案三: 选用构象特异性或链型特异二抗,以避免重链和/或轻链的干扰。

构象特异性二抗,仅识别空间构象表位,高温变性的抗体失去了原有的空间构象,不会被识别,因此不会产生重链(~50kDa)和轻链(~25kDa)的条带。

当目标蛋白位于50kDa分子量附近时,可选择抗轻链的二抗,不识别重链,不会产生重链(~50kDa)的条带。

当目标蛋白位于25kDa分子量附近时,可选择抗重链端的二抗,不识别轻链,不会产生轻链(~25kDa)的条带。

部分相关产品如下:

货号    种属来源/对应一抗种属(标记) 轻/重链特异性
93702 Mouse Anti-Rabbit IgG (Light-Chain Specific) (D4W3E) mAb (HRP Conjugate)  抗轻链特异性,避免重链干扰
58802 Rabbit Anti-Mouse IgG (Light Chain Specific) (D3V2A) mAb (HRP Conjugate) 抗轻链特异性,避免重链干扰
115-035-008 HRP-Goat Anti-Mouse IgG, Fcγ Secondary Antibody 抗重链特异性,避免轻链干扰
111-035-008 HRP-Goat Anti-Rabbit IgG, Fc Secondary Antibody 抗重链特异性,避免轻链干扰
5127 Mouse Anti-rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (HRP Conjugate) 同时避免轻&重链干扰

注:文章内容来源于小优大学堂讲座《抗体选择最全指南》,点击此处观看讲座视频

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