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技术资料/正文

文献解析|原位形成抗菌水凝胶:凭借胶原酶响应活性预防 MRSA 所致骨髓炎

626 人阅读发布时间:2025-02-13 14:33

Part.1/ 研究背景

 

 

骨髓炎是一种在骨科手术和骨外伤后经常出现的感染性疾病。即便在术前已经预防性地使用了抗生素,骨折手术后骨髓炎的发病几率依旧居高不下。骨髓炎伴随着严重的细菌感染和持续不断的炎症反应,这种情况会造成骨质受损破坏、器官功能衰竭以及脓毒症,在病情严重时甚至会对生命构成威胁。在引发骨髓炎的病原体中,金黄色葡萄球菌最为常见。随着微生物多重耐药现象的发展,耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)感染逐渐成为导致骨髓炎的主要原因,这使得骨髓炎的治疗难度进一步加大,成为了一个更难处理的棘手病症。直到现在,在临床实践中,骨髓炎仍然缺少规范且行之有效的治疗策略。
 
 
技术资料图片1
 
 
Part.2/ 设计思路
 
作者精心创制了一种原位形成的抗菌水凝胶,其具备胶原酶反应活性,旨在预防由耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)所诱导的骨髓炎。该水凝胶的构建基于四臂聚乙二醇马来酰亚胺(4 - Arm - PEG - Mal)、n - 氨基马来酰亚胺化抗菌肽(Mal - AMP)和双巯基胶原酶可切割肽(HS - VPM - SH)之间化学键的形成。在胶原酶的作用下,水凝胶可发生切割,此切割过程能够依据需求释放抗菌肽,从而强化在感染环境中对抗 MRSA 的活性,为骨髓炎的预防提供了一种极具潜力的解决方案。
 
 
Part.3/ 研究内容
 
 
作者精心设计了一种抗菌肽(抗菌肽 AMP),此抗菌肽含有 WRKFRRFKFRW(简称为 WRK)序列。为全面评估其临床应用潜力,作者深入探究了 WRK 肽的杀菌动力学特性以及诱导细菌耐药的可能性。
 

研究结果清晰地表明,WRK 肽在杀灭耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的速度方面,显著优于传统抗生素。这种高效的杀菌能力,有力地限制了细菌耐药性和耐受性的发展。在针对抗菌药物耐药性的测定中,结果明确显示,在长期治疗过程中,WRK 肽诱导细菌产生耐药性的概率较低,这一特性在骨髓炎的防治工作中展现出极大的优势。
 

继而,作者对 WRK 肽的抗菌作用机制展开了深入研究。研究结果证实,WRK 肽可能是通过插入细菌膜,破坏呼吸电子传递链,从而诱导细菌内部产生过量的内源性活性氧(ROS)来发挥其抑菌作用的。这一系列研究为 WRK 肽在抗菌领域的应用提供了坚实的理论依据。
 
 
技术资料图片2
 
 
4 - Arm - PEG - Mal 溶液与 Mal - AMP/HS - VPM - SH 溶液经简易混合操作后,即可完成 AMP/VPM/PEG 水凝胶的制备。在该水凝胶体系中,AMP(抗菌肽)承担着关键的抗菌职能,其对于整个水凝胶的抗菌性能有着决定性作用。
 
 

而连接肽 VPM 具有特殊的生物学特性,它可在感染区域过表达的胶原酶作用下发生裂解。这种裂解作用对于水凝胶的功能实现具有重要意义,能够触发水凝胶的破坏过程,并促使 AMP 从水凝胶结构中释放出来,进而在感染部位发挥抗菌作用。
 
 

为深入探究水凝胶的物理特性,作者采用凝胶流变仪对水凝胶在不同频率条件下的模量进行了精确测量。实验结果显示,在交替应变的作用下,水凝胶呈现出卓越的回弹性。并且,当外部应力去除后,AMP/VPM/PEG 水凝胶能够迅速且精准地恢复至初始状态。这些现象从专业角度表明,该水凝胶具备良好的可注射性,这一特性为其在医疗领域的应用,尤其是在骨髓炎等感染性疾病的治疗应用中,奠定了坚实的理论和实践基础。
 
 
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为对酶的反应性展开研究,作者把 AMP/VPM/PEG 水凝胶分别放置于 1mg/mL 的胶原酶 I 溶液以及 PBS 中。处于 PBS 溶液里的水凝胶出现吸水膨胀现象,而在胶原酶 I 溶液中的水凝胶则转变为浑浊液体。在 PBS 环境下,释放出的 AMP 浓度维持在较低水平。这种由胶原酶增强的递送方式,避免了因局部药物浓度过高而引发不必要的细胞毒性。

随后,作者对 AMP/VPM/PEG 水凝胶在不同环境下针对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的抗菌活性进行了测试。AMP/VPM/PEG 水凝胶在 PBS 中产生了与水凝胶直径(6.0mm)相近的抑制带(直径 6.9mm),然而当存在 50μg/mL 的胶原酶 I 时,抑制带直径可扩大至 14.3mm。不同浓度胶原酶 I 下的抑制区表明,胶原酶 I 水平的升高能够促进 AMP 的释放,进而提升抗菌能力。但是,当胶原酶 I 含量达到 500μg/mL 时,此浓度远远高于机体正常水平,有可能会降解 AMP,对其抗菌性能产生不良影响。
 
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作者运用 SD 大鼠胫骨骨髓炎模型来评估 AMP/VPM/PEG 水凝胶在体内对骨髓炎的预防作用。由图可看到,阳性对照大鼠的手术部位呈现出明显的肿胀。与之相反,AMP/VPM/PEG 水凝胶组的大鼠未出现四肢肿胀的情况。在第 28 天,阳性对照组和 VPM/PEG 水凝胶组的大鼠大部分出现关节挛缩,进而导致行走障碍。而阴性对照组和 AMP/VPM/PEG 水凝胶组的大鼠行走正常。在第 14 天和第 28 天对大鼠下肢进行 Micro-CT 扫描。扫描图像显示,阳性对照组大鼠骨骼信号较弱,表面显得粗糙,据此推测骨骼已经坏死。更为严重的是,能够看到胫骨干骺端不均匀,这表明骨质遭到破坏。这些特征充分证明了骨髓炎的发生。与此形成鲜明对比的是,AMP/VPM/PEG 水凝胶组和阴性对照组的大鼠骨边缘清晰,骨表面完整,髓腔透明,信号正常。
 
 
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作者为了进一步评估炎症水平,在第 28 天对血清中作为感染性炎症标志物的 C 反应蛋白(CRP)浓度进行了测量。阴性对照组和 AMP/VPM/PEG 水凝胶组未检测到 CRP,而阳性对照组和 VPM/PEG 水凝胶组则检测到了 CRP。这一结果提示,外用 AMP/VPM/PEG 水凝胶能够预防耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)感染。

在第 28 天处死大鼠以进行进一步分析。阴性对照组和 AMP/VPM/PEG 水凝胶组未检出 MRSA,阳性组的细菌计数较高。接着,作者测量了注射部位周围组织匀浆中的两种炎症因子,即肿瘤坏死因子 -α(TNF-α)和白细胞介素 - 6(IL-6)。结果表明,AMP/VPM/PEG 水凝胶组的炎症因子水平与阴性对照组相似,而其他两个感染组的炎症因子水平显著升高。

在第 28 天,通过 H&E 染色和免疫组织化学染色对胫骨进行组织学分析。在 H&E 染色中,阴性对照组的软骨、髓样组织和骨组织均未见异常,在骨小梁之间可以看到造血干细胞。阳性对照组则可见大量聚集的中性粒细胞,并且周围有大量的组织细胞和上皮样细胞,这表明存在炎症反应。从免疫组化染色来看,与阴性对照组相比,阳性对照组和 VPM/PEG 水凝胶组的炎症水平更高。AMP/VPM/PEG 水凝胶组的 MMP-3 水平与阴性对照组几乎相同,这表明没有明显的炎症反应。

综上所述,以上结果充分证实了 AMP/VPM/PEG 水凝胶的植入能够有效地预防体内由 MRSA 诱导的骨髓炎。具体来说,通过对不同组大鼠在第 28 天的各项指标检测,包括血清 CRP 浓度测量、细菌计数、炎症因子水平测定以及组织学分析等,明确显示了 AMP/VPM/PEG 水凝胶在预防 MRSA 感染和骨髓炎方面的显著效果。阴性对照组和AMP/VPM/PEG 水凝胶组在多个指标上表现相似,都呈现出较低的炎症水平和无 MRSA 检出的良好状态,与阳性对照组和 VPM/PEG 水凝胶组形成鲜明对比。这一系列的实验结果有力地支撑了 AMP/VPM/PEG 水凝胶在体内预防骨髓炎的有效性。
 
 
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Part.4/ 总结与展望
 
 
面对后抗生素时代,这项工作为以抗菌肽(AMP)为基础的治疗和深层感染预防提供了有用的策略。

作者采用原位化学键合法构建了一种具有胶原酶降解特性的抗菌水凝胶,该水凝胶可用于预防耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)感染的骨髓炎。具有按需药物释放特性的局部用药,不仅可以最大限度地减少不良反应,还能减少抗菌药物的过度使用和耐药性的发生。其中,通过可降解肽将药物共价连接到水凝胶网络的策略是可行的,它能够提高药物的载药量,防止药物的过度释放。这种按需释放可快速增加感染区域抗菌药物的浓度,从而增强治疗效果。
 
 
 

 

名称 货号 规格
胶原酶 Ⅳ型 abs47048003-1g 1g
胶原酶 II型 abs47048001-100mg 100mg
胶原酶 III型 abs47048002-1g 1g
胶原酶 I型 abs47048000-100mg 100mg

 

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