文献解析|PUMILIO蛋白：抑制p21，加速结直肠癌生长

PUMILIO Proteins Promote Colorectal Cancer Growth via Suppressing p21

引言

结直肠癌（CRC）作为全球最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率居高不下，给公共卫生带来了巨大挑战。根据2018年全球流行病学数据，CRC在所有癌症中占比10%，居第三位，而死亡率则居第二位。尽管近年来在CRC的遗传和分子机制方面取得了显著进展，如APC、TP53、KRAS等基因的改变以及Wnt、RAS-MAPK、PI3K等关键信号通路的作用已被广泛研究，但CRC的发病率和死亡率依然居高不下，并呈现出上升趋势。因此，探索CRC发病机制的新分子机制，对于实现早期检测、诊断和靶向治疗至关重要。

最近的研究表明，RNA结合蛋白在CRC的起始和发展过程中扮演着重要角色。然而，这些蛋白在CRC中的确切作用以及它们如何调控CRC中的RNA靶点，在很大程度上仍是未知的。PUMILIO蛋白（PUM1和PUM2）作为一类重要的RNA结合蛋白，近年来引起了广泛关注。本文将对2022年3月25日发表在Nature Communications杂志上的一项研究进行解析，该研究由来自中国上海科技大学的Yuanyuan Gong及其团队完成，题为“PUMILIO proteins promote colorectal cancer growth via suppressing p21”。

研究背景

PUMILIO蛋白（PUM蛋白）是一类高度保守的RNA结合蛋白，最初在果蝇中被发现，并因其对Nanos mRNA的调控作用而得名。在哺乳动物中，PUM蛋白家族包括PUM1和PUM2两个成员，它们通过结合特定的mRNA序列（即Nanos响应元件，NRE），参与调控mRNA的稳定性、翻译效率和定位。近年来，越来越多的研究表明，PUM蛋白在多种人类疾病中发挥着重要作用，包括癌症、神经退行性疾病和病毒感染等。

在癌症方面，PUM蛋白的异常表达与多种肿瘤的发生和发展密切相关。例如，在乳腺癌、肺癌和前列腺癌等肿瘤中，PUM蛋白的表达水平显著升高，且其高表达与不良预后和肿瘤进展呈正相关。然而，关于PUM蛋白在CRC中的具体作用及其机制，目前仍缺乏深入研究。

研究方法

在本研究中，Yuanyuan Gong及其团队采用了多种实验方法和技术手段，系统地探讨了PUM1和PUM2在CRC中的功能和作用机制。具体方法包括：

1. 数据库分析和临床样本检测：研究者首先利用两个在线数据库（人类蛋白质图谱和癌症基因组图谱TCGA）分析了PUM1和PUM2在不同肿瘤中的表达情况，并收集了来自22例CRC患者的人类CRC样本及其邻近组织，对PUM1和PUM2的mRNA表达进行了成对比较。

2. 转录组测序：为了探索PUM蛋白在CRC中的分子机制，研究者利用深度测序技术分析了Pum1-/-和Pum2-/- HCT116细胞的转录组，鉴定了差异表达基因，并进行了主成分分析（PCA）以评估实验的可重复性。

3. RNA深度测序和蛋白质质谱分析：研究者进一步利用RNA深度测序和蛋白质质谱分析技术，探讨了PUM1对p21的调控作用，并验证了其在RNA和蛋白质水平上的变化。

4. RNA共免疫沉淀（RIP）实验：为了确定PUM蛋白与p21 mRNA的直接结合作用，研究者进行了RIP实验，并比较了PUM1和PUM2对p21 mRNA的富集程度。

5. 动物实验：最后，研究者利用CRC模型小鼠，通过静脉注射纳米颗粒包装的抗PUM SiRNA，评估了抗PUM治疗对肿瘤生长的影响。

研究结果

1. PUM1和PUM2在CRC中表达增加

研究者首先分析了两个在线数据库中的数据，发现与其他癌症类型相比，PUM1在CRC中具有最高的蛋白质水平，并且PUM2在CRC中也高表达。进一步分析TCGA数据集显示，与正常结肠组织相比，CRC组织中Pum1的转录物表达水平较高，而Pum2的表达水平则相对较低。为了验证这一结果，研究者对来自22例CRC患者的人类CRC样本及其邻近组织中的mRNA表达进行了成对比较，发现Pum1和Pum2在CRC临床标本中高度表达。特别是，在15例患者中Pum1的mRNA水平比其配对的邻近正常组织高至少10倍，而在13例患者中Pum2的mRNA水平也呈现出类似的高表达。此外，TCGA数据集还显示，Pum1的表达与CRC阶段呈正相关，而Pum2的表达则与CRC阶段无显著相关性。受试者工作特性（ROC）曲线分析进一步表明，在CRC中，Pum1的诊断价值高于Pum2。此外，PUM1的表达与CRC患者的生存率可能存在负相关。这些数据表明，PUM1和PUM2参与了人类CRC的进展。

2. PUM1主要通过直接调控癌相关基因和细胞周期相关基因发挥作用

为了探索CRC中PUM功能的分子机制，研究者利用深度测序技术分析了Pum1-/-和Pum2-/- HCT116细胞的转录组。在Pum1敲除细胞中，研究者鉴定了1132个差异表达基因，其中740个基因的mRNA水平升高，392个基因的mRNA水平降低。值得注意的是，几个细胞周期抑制因子基因被上调，包括Cdkn1a/p21、Cdkn2d和Cdkn2c，这些基因的肿瘤抑制功能已得到充分证实。此外，一个关键的癌基因Myc被下调。同样，在Pum2敲除细胞中，研究者也鉴定了差异表达基因，并发现上调基因包含一组略有不同的细胞周期基因，如Ccnd3和Tgfb1。这些结果表明，PUM1和PUM2在CRC中可能通过调控不同的细胞周期基因来发挥作用。

3. PUM1直接抑制p21以调控CRC的生长

在PAR-CLIP-seq实验揭示的PUM1直接靶点中，p21是一个重要的G1/S相变调控因子。此外，p21表达与CRC的总生存率呈负相关。因此，研究者重点研究了PUM蛋白对p21的调控作用。RNA深度测序和蛋白质质谱分析显示，p21在RNA和蛋白质水平上都受到PUM1的抑制。进一步利用RT-qPCR和蛋白质印迹法验证发现，Pum1-/-细胞中p21的RNA和蛋白水平均显著升高，而Pum2-/-细胞中p21 RNA和蛋白水平的增加则不如Pum1-/-细胞中的增加显著。与此一致，RIP实验表明，p21 mRNA被Pum1强结合（7.4倍富集），而被Pum2弱结合（1.9倍富集）。这些结果表明，PUM1通过直接抑制p21来调控CRC的生长。

4. 抗PUM治疗可有效降低CRC肿瘤生长

最后，研究者利用CRC模型小鼠，通过静脉注射纳米颗粒包装的抗PUM SiRNA，评估了抗PUM治疗对肿瘤生长的影响。结果发现，抗PUM治疗显著降低了CRC模型小鼠的肿瘤生长。这一结果进一步支持了PUM蛋白在CRC中的重要作用，并为抗PUM治疗CRC提供了潜在的新途径。

结论与展望

本研究系统地探讨了PUM1和PUM2在CRC中的功能和作用机制，并得出了以下结论：

1. PUM1和PUM2在人类CRC中表达增加，且PUM1的表达与CRC阶段和患者生存率呈负相关。

2. PUM1主要通过直接调控癌相关基因和细胞周期相关基因（如p21）来发挥作用，而PUM2则可能通过调控不同的细胞周期基因来影响CRC的进展。

3. PUM1通过直接抑制p21来调控CRC的生长，这一发现为深入了解CRC肿瘤发生的重要分子机制提供了新见解。

4. 抗PUM治疗可有效降低CRC肿瘤生长，为CRC的潜在新治疗途径提供了实验依据。

展望未来，研究者将进一步深入探讨PUM蛋白在CRC中的具体作用机制，以及与其他信号通路的相互作用关系。同时，也将继续优化抗PUM治疗策略，以期实现CRC的早期检测、诊断和靶向治疗。此外，鉴于PUM蛋白在多种人类疾病中的重要作用，研究者还将探索其在其他疾病中的潜在作用机制和治疗靶点，为更多疾病的治疗提供新的思路和方法。