文献解析|基于报告基因法检测靶向TIGIT治疗性抗体的生物活性

一、引言

T细胞免疫球蛋白和ITIM结构域（TIGIT）作为一种新兴的免疫检查点，在癌症免疫治疗中备受关注。针对TIGIT的治疗性抗体因其潜在的免疫调节作用而具有广阔的应用前景。然而，目前用于测量针对TIGIT的治疗性抗体生物活性的生物测定法主要局限于机理研究，由于供体原始T细胞的高度变异性，这些方法的普遍适用性受到限制。为了克服这一挑战，本文设计了一种基于报告基因的测定方法，旨在提供一种可靠、有效且适用于多种应用场景的检测手段。

二、研究背景

2.1 TIGIT的免疫调节功能

TIGIT属于免疫球蛋白超家族成员，主要表达在免疫细胞表面，包括T细胞、NK细胞和树突状细胞等。它通过与配体如CD112（PVRL2，nectin-2）和CD155（PVR）的相互作用，在调节免疫应答中发挥重要作用。TIGIT-CD112/CD155信号通路能够抑制T细胞和NK细胞的活化，从而维持免疫稳态，防止过度免疫应答导致的组织损伤。然而，在肿瘤微环境中，TIGIT的高表达常常与肿瘤免疫逃逸和不良预后相关。因此，靶向TIGIT的治疗性抗体成为癌症免疫治疗的新策略。

2.2 当前生物测定法的局限性

目前，用于测量针对TIGIT的治疗性抗体生物活性的方法主要依赖于供体原始T细胞。然而，这些细胞具有高度变异性，导致不同批次实验结果的一致性较差。此外，这些方法通常复杂且耗时，难以满足高通量筛选和药物研发的需求。因此，开发一种更可靠、更高效、更适用于多种应用场景的检测方法显得尤为重要。

三、研究方法

3.1 实验设计

本文设计了一种基于报告基因的测定方法，该方法利用两种稳定表达特定分子的细胞系，即CHO-CD112-CD3 scFv细胞（目标细胞）和Jurkat-NFAT-TIGIT细胞（效应细胞）。CHO-CD112-CD3 scFv细胞稳定表达CD112和膜结合的抗CD3单链片段可变区（scFv），而Jurkat-NFAT-TIGIT细胞稳定表达TIGIT以及由活化T细胞核因子（NFAT）响应元件控制的荧光素酶基因。

3.2 实验步骤

1. 细胞培养：分别培养CHO-CD112-CD3 scFv细胞和Jurkat-NFAT-TIGIT细胞至适当密度。

2. 细胞混合：将目标细胞和效应细胞按一定比例混合，并加入待测的治疗性抗体。

3. 抗体作用：抗-CD3 scFv与目标细胞上的CD3分子结合，通过交联作用激活效应细胞。同时，CD112与TIGIT的相互作用阻止效应细胞的活化。

4. 报告基因表达：加入抗-TIGIT单克隆抗体（mAbs）后，它会破坏CD112与TIGIT的相互作用，从而逆转效应细胞的失活状态，并启动荧光素酶基因的表达。

5. 荧光检测：通过荧光测定仪检测荧光素酶的活性，进而反映治疗性抗体的生物活性。

3.3 方法优化与验证

为了确保该测定方法的可靠性，研究者对其特异性、准确性、线性和精确度进行了优化和验证。通过调整细胞比例、抗体浓度和反应时间等参数，优化了测定条件。同时，利用已知生物活性的抗-TIGIT抗体作为标准品，验证了该方法的准确性和精确度。

四、实验结果

4.1 测定方法的特异性

通过对比不同抗体与测定系统的反应，研究者发现该方法对针对TIGIT的抗体具有高度的特异性。当加入非特异性抗体时，荧光素酶的活性没有显著变化；而当加入针对TIGIT的特异性抗体时，荧光素酶的活性显著增加。这表明该测定方法能够准确区分针对TIGIT的抗体和非特异性抗体。

4.2 测定方法的准确性

利用已知生物活性的抗-TIGIT抗体作为标准品，研究者对该测定方法的准确性进行了验证。结果显示，测定结果与标准品的生物活性高度一致，表明该方法具有较高的准确性。

4.3 测定方法的线性和精确度

研究者通过改变待测抗体的浓度，测定了该方法的线性和精确度。结果显示，该方法在较宽的抗体浓度范围内具有良好的线性关系，且精确度较高。这表明该方法能够准确反映待测抗体的生物活性水平。

五、讨论

5.1 测定方法的优势

与现有的基于供体原始T细胞的生物测定法相比，本文设计的基于报告基因的测定方法具有以下优势：

1. 可靠性：该方法利用稳定表达特定分子的细胞系，避免了供体原始T细胞的高度变异性，提高了实验结果的可靠性。

2. 高效性：该方法操作简便、耗时短，适用于高通量筛选和药物研发等应用场景。

3. 普适性：该方法不仅适用于针对TIGIT的治疗性抗体，还可通过调整细胞系和报告基因等元件，拓展至其他免疫检查点的抗体检测。

5.2 测定方法的应用前景

该测定方法在癌症免疫治疗领域具有广阔的应用前景。它可用于评估针对TIGIT的治疗性抗体的生物活性，为药物筛选、优化和临床试验提供有力支持。此外，该方法还可用于监测患者体内的抗体水平，指导个性化治疗方案的制定和调整。

5.3 测定方法的局限性及未来研究方向

尽管该测定方法具有诸多优势，但仍存在一些局限性。例如，该方法目前仅适用于体外检测，尚需进一步探索其在体内环境下的应用效果。此外，随着免疫检查点研究的不断深入，未来可进一步拓展该方法的检测范围，包括其他免疫检查点及其相关抗体的检测。

六、结论

本文设计了一种基于报告基因的测定方法，用于检测针对TIGIT的治疗性抗体的生物活性。该方法具有可靠性高、操作简便、耗时短、普适性强等优点，在癌症免疫治疗领域具有广阔的应用前景。通过优化和验证，该方法已展现出良好的特异性、准确性、线性和精确度，为药物筛选、优化和临床试验提供了有力支持。未来，研究者可进一步拓展该方法的检测范围和应用场景，为癌症免疫治疗的发展做出更大贡献。