文献解析|基于适配体的光响应纳米平台实现细胞内蛋白的亚细胞定位光学操控

一、引言

蛋白质作为生命活动的主要承担者，在细胞内的功能与其亚细胞定位密切相关。对蛋白质的亚细胞定位进行精确控制，是理解其在复杂生物网络中作用的关键。传统的蛋白质操控方法，如化学修饰或遗传工程，往往会对蛋白质的自然结构和表达产生较大干扰，限制了其在研究中的应用。近年来，光学调控作为一种无创、时空分辨率高的调控手段，逐渐成为研究蛋白质动态行为的重要工具。特别是适配体（Aptamer）作为一类通过体外筛选得到的单链寡核苷酸，能特异性识别目标蛋白，并具有易于修饰、设计灵活等特性，在蛋白质调控领域展现出巨大的潜力。

本文介绍了一篇发表在Nature Communications上的文章，题为“Aptamer-based optical manipulation of protein subcellular localization in cells”，由湖南大学化学化工学院的谭蔚泓院士团队完成。该研究创新性地开发了一种基于适配体的光响应纳米平台，实现了对细胞内蛋白质亚细胞定位的精确控制，为蛋白质功能研究提供了一种新的有力工具。

二、研究背景

细胞内蛋白质的亚细胞定位是其发挥功能的基础。不同的亚细胞定位决定了蛋白质与不同细胞成分（如DNA、RNA、其他蛋白质等）的相互作用，进而影响细胞的生理和病理过程。为了研究蛋白质在亚细胞水平上的活动，需要一种能够在不改变蛋白质自然结构和表达的情况下，对其亚细胞定位进行精确控制的策略。

光学调控作为一种非侵入性的调控手段，具有时空分辨率高、操作简便等优点。然而，将光学调控应用于细胞内蛋白质的亚细胞定位控制，需要解决的关键问题是如何设计一个能够特异性识别目标蛋白，并能在光刺激下发生构象变化从而调控蛋白质亚细胞定位的分子识别单元。

适配体作为一种单链寡核苷酸，具有对目标分子的高特异性和高亲和力，并且易于进行化学修饰，因此成为设计这种分子识别单元的理想选择。然而，之前的研究大多局限于试管内或细胞表面，对于细胞内部蛋白质的亚细胞定位调控仍面临挑战。

三、研究内容

1. 基于适配体的光响应纳米平台设计

该研究设计了一种基于适配体的光响应纳米平台，该平台包含目标蛋白（RelA）、识别RelA蛋白的适配体（Apt）、相应的互补结合链（cDNA、bDNA）、以及上转换纳米粒子（UCNPs）等组件。RelA作为NF-κB家族的一种亚单位蛋白，是参与许多细胞信号通路的必需转录因子，因此被选作模型蛋白。

适配体能特异性识别RelA蛋白，并与其结合。为了实现对目标蛋白的时空调控，作者设计了一种光响应双链杂交体作为适配体功能构象的调控单元。一条DNA链（命名为cDNA）与适配体的序列部分互补，而另一条含有光激活剪切基团（PC-linkers）的阻断探针（称为bDNA）。这样，cDNA与bDNA杂交后，会阻断适配体与RelA蛋白的结合。

为了避免光调节系统中常用的紫外光对细胞的生物损伤，作者选用了具有将近红外激发转化为紫外光发射能力的上转换纳米粒子（UCNPs）作为蛋白质聚集的“核心”。适配体和可光切割的cDNA/bDNA杂交体（PCHx，其中x代表插入bDNA序列中的PC接头的数量）被结合到UCNPs的表面，所得纳米粒子被称为PCHx-适配体-UCNPs。

在近红外激光激发下，UCNP可以发出紫外光来切割PC-linkers，从而释放出与适配体杂交的cDNA，使适配体恢复对RelA蛋白的结合能力。通过调节近红外激光的照射时间和强度，可以控制PC-linkers的切割速率和程度，从而实现对RelA蛋白亚细胞定位的精确调控。

2. 纳米平台的构建与表征

为了评估序列设计的可行性，作者在cDNA的3’端修饰了Cy3荧光基团，在适配体的5’端修饰了Cy5基团。当两者结合时，会产生荧光共振能量转移（FRET）信号，用于评估DNA的杂交动力学。实验结果表明，当适配体、cDNA和bDNA以1:1:1比例混合时，cDNA会优先与bDNA杂交，从而产生弱的FRET信号。而在紫外线照射下，PC-linkers会被迅速切割，释放出与适配体杂交的cDNA，使Cy3荧光团和Cy5荧光团聚集在一起，导致FRET信号增强。同时，FRET增强的信号与紫外线照射时间成比例。

此外，作者还通过流体动力学直径测量、吸收光谱分析和荧光光谱分析等手段对PCH2-适配体-UCNPs进行了表征。结果表明，DNA探针成功修饰到了UCNPs表面，且不影响UCNPs的光学性质。

3. 细胞内天然蛋白定位的光学操作

为了验证该纳米平台在细胞内的应用效果，作者选择了肺癌细胞系A549作为细胞模型。将A549细胞与PCH2-适配体-UCNPs孵育不同时间长度后，用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）监测适配体的Cy5信号以及细胞的摄取和分布情况。实验结果表明，随着孵育时间的增加，细胞对PCH2-适配体-UCNPs的摄取逐渐增强。同时，PCH2-适配体-UCNPs的溶酶体（或晚期内体）分布逐渐减少，大部分纳米粒子从溶酶体转移到细胞质中。

进一步地，作者通过TNFα刺激A549细胞激活RelA蛋白，并观察其在不同处理条件下的亚细胞定位情况。实验结果表明，在未用PCH2-适配体-UCNPs处理的细胞中，RelA蛋白在TNFα刺激下迅速进入细胞核。而在用PCH2-适配体-UCNPs处理的细胞中，RelA蛋白主要保留在细胞质中。在近红外激光照射后，RelA蛋白的亚细胞定位恢复到与仅用TNFα刺激的对照样品相似的水平。这表明该纳米平台能够实现对RelA蛋白亚细胞定位的精确调控。

4. 靶蛋白相关基因程序的光学调控

为了进一步研究该纳米平台对靶蛋白相关基因程序的影响，作者观察了RelA蛋白在核转移过程中对相关基因表达的影响。实验结果表明，在用TNFα刺激A549细胞后，IκBα mRNA的表达水平显著增强。而用PCH2-适配体-UCNPs处理后，RelA蛋白主要保留在细胞质中，导致IκBα mRNA的明显抑制。在近红外激光照射后，IκBα的表达恢复到与仅用TNFα刺激的对照样品相似的水平。这表明该纳米平台能够通过调控RelA蛋白的亚细胞定位来影响相关基因的表达水平。

此外，作者还观察了A20基因表达的光调节情况。实验结果表明，A20基因表达的光调节与IκBα基因表达分析的结果相似。这进一步证实了该纳米平台在调控靶蛋白相关基因程序方面的有效性。

5. 纳米平台的普适性验证

为了验证该纳米平台的普适性，作者建立了p53/适配体体系，并测试了其在细胞质到细胞核转移之外的不同易位模式下进行蛋白质操作的潜力。实验结果表明，通过使用该纳米平台，可以实现对癌症相关突变型p53（p53R175H）的亚细胞定位的精确调控，并观察到其向线粒体的易位增强。这初步表明该纳米平台可以扩展到操纵具有不同亚细胞易位模式的不同蛋白质。

四、结论与展望

本文开发了一种基于适配体的近红外响应纳米平台，用于操纵天然蛋白质的转运活性，从而以分子特异性在活细胞中调节它们的亚细胞定位。该纳米平台的设计巧妙地结合了适配体的分子识别能力、UCNPs的光学转换能力和光响应链置换反应的可控性，实现了对细胞内蛋白质亚细胞定位的精确调控。

与传统的蛋白质操控方法相比，该纳米平台具有以下优点：

（1）无需对目标蛋白质进行化学或遗传修饰，减少了对蛋白质天然结构和表达的人为干扰；

（2）通过光学调控实现时空分辨率高的蛋白质定位控制；

（3）利用UCNPs将近红外光转化为紫外光，克服了常用紫外光的生物损伤和光毒性高的问题。

该纳米平台的应用前景广阔，可以用于研究蛋白质的动态行为、揭示蛋白质在复杂生物网络中的潜在作用、以及开发针对特定蛋白质的功能性药物等。然而，该纳米平台仍存在一些挑战和需要进一步研究的问题：

（1）由于尺寸限制，对来自小细胞器的蛋白质易位实施可逆控制仍具有挑战性；

（2）需要进一步研究该纳米平台对细胞状态的潜在影响，并提高其对更精确和更精细的蛋白质操作的能力；

（3）对于实际应用，该纳米平台的潜在非目标效应需要进一步评估。

未来，随着核酸适配体和核酸化学的快速发展，该纳米平台有望扩展到操作具有不同亚细胞易位模式的不同生物分子。同时，通过进一步优化设计和改进技术，有望实现对细胞内蛋白质亚细胞定位的更加精确和可控的调控。这将为深入理解蛋白质的生理功能、揭示疾病发生发展的机制以及开发新的治疗策略提供有力支持。