文献解析|N6-methyladenosine诱导的circ1662通过加速YAP1核定位促进结直肠癌转移

引言

结直肠癌（CRC）是世界上最常见的恶性肿瘤之一，其高转移性是导致患者死亡的主要原因。近年来，环状RNA（circRNA）在癌症进展中的作用逐渐受到关注。然而，circRNA在CRC转移中的调控机制仍不清楚。本研究团队通过高通量测序、RNA原位杂交（ISH）、免疫组化（IHC）以及多种分子生物学实验方法，揭示了一种新的circRNA——circ1662，在CRC转移中的重要作用及其调控机制。本研究不仅为CRC转移机制提供了新的见解，也为CRC的预后和治疗提供了新的标志物和潜在靶点。

材料与方法

1. 样本收集与测序

研究团队收集了6对CRC组织及其相邻正常组织，进行高通量测序，以识别mRNA和circRNA的表达谱。通过RNA-ISH和IHC，对组织芯片中的circ1662进行评估。

2. circ1662功能评估

通过敲低或过表达circ1662，评估其在CRC中的功能。利用CRC细胞系HCT116和SW480，设计circ1662的siRNA和过表达载体，分析干扰或过表达circ1662后细胞迁移和侵袭的变化情况。

3. 分子生物学实验

利用MeRIP-qPCR、RIP-qPCR和RNA pull-down实验，确定METTL3、circ1662和YAP1之间的关系。通过免疫荧光、Western blot和qPCR等方法，进一步解析circ1662调控CRC转移的分子机制。

4. 动物实验与临床分析

通过尾静脉注射稳定过表达circ1662的CRC细胞，评估circ1662对CRC肺转移的影响。同时，在临床标本中分析METTL3、circ1662、YAP1和SMAD3的表达相关性。

结果

1. circ1662在CRC组织中的高表达及其与预后的关系

研究团队首先通过高通量测序，发现circ1662在CRC组织中的表达显著高于相邻正常组织。进一步分析显示，circ1662的高表达与CRC患者的预后不良和肿瘤深度相关。这一结果提示circ1662可能在CRC的发生和发展中起重要作用。

2. circ1662促进CRC细胞的侵袭和迁移

为了评估circ1662在CRC中的功能，研究团队设计了circ1662的siRNA和过表达载体，并在CRC细胞系HCT116和SW480中进行了实验。结果显示，敲低circ1662显著抑制了CRC细胞的迁移和侵袭能力，而过表达circ1662则显著促进了CRC细胞的迁移和侵袭。这一结果证实了circ1662在CRC转移中的重要作用。

3. circ1662通过调控YAP1核定位促进CRC转移

为了解析circ1662促进CRC转移的分子机制，研究团队进行了进一步的研究。通过原位杂交和胞质-核组分分离实验，发现circ1662既可以定位在细胞质中，也可以定位在细胞核中。利用catRAPID工具分析和anti-YAP1的RIP-qPCR实验，证明circ1662具有结合YAP1的功能，并能促进YAP1的核定位。进一步的研究表明，过表达circ1662后，YAP1的核定位增加，同时YAP1的S127磷酸化下降。这一结果说明circ1662通过结合并促进YAP1核定位，从而促进了CRC的转移。

4. circ1662通过YAP1抑制SMAD3的表达

为了进一步解析circ1662调控CRC转移的下游信号通路，研究团队分析了与circ1662和YAP1相关的KEGG通路。结果显示，胰岛素、TGF-β、HIF-1、FoxO、MAPK和Rap1通路在CRC组织中显著富集。通过干扰circ1662后检测这些通路相关的核心基因，发现SMAD3是circ1662通过YAP1调控的下游基因。进一步实验结果表明，干扰YAP1可明显促进SMAD3的表达水平。免疫荧光检测也证明了circ1662通过YAP1抑制SMAD3的表达。这一结果揭示了circ1662/YAP1/SMAD3轴在CRC转移中的重要作用。

5. METTL3诱导circ1662表达

为了探究circ1662表达的调控机制，研究团队进行了meRIP-qPCR实验，发现在circ1662的上游和下游侧翼内含子中存在m6A修饰。进一步分析显示，METTL3是调控circ1662表达的RNA甲基化酶。通过Anti-METTL3 RIP实验证明，circ1662上下游侧翼内含子中携带m6A的一些区段可被METTL3有效富集，说明METTL3介导了这些位点的m6A甲基化。进一步实验表明，过表达METTL3可显著提高circ1662的表达水平。这一结果揭示了METTL3通过m6A修饰诱导circ1662表达的新机制。

6. METTL3通过circ1662/YAP1/SMAD3途径促进CRC转移

为了验证METTL3是否通过circ1662/YAP1/SMAD3轴调控CRC转移，研究团队设计了干扰METTL3、circ1662和YAP1的实验体系。结果显示，干扰METTL3后，circ1662的表达显著降低，同时YAP1的核定位减少，SMAD3的表达增加，CRC细胞的迁移和侵袭能力减弱。这一结果说明METTL3通过促进circ1662的生成，正向调控circ1662/YAP1/SMAD3轴，并最终促进CRC的转移。动物实验也证明了这一点，干扰METTL3后过表达circ1662可增加肺转移灶的数目。

7. 临床标本分析

最后，研究团队在CRC组织芯片中分析了METTL3、circ1662、YAP1和SMAD3的表达相关性。结果显示，高表达circ1662的标本中METTL3和YAP1都表达较高。在AJCC III-IV级标本中，YAP1表达与circ1662正相关，但在I-II级标本中表达相关性不强。GEO数据显示，YAP1表达与SMAD3负相关。这些临床表达相关性分析结果验证了本研究中提出的机制。

讨论

本研究首次揭示了circ1662在CRC转移中的重要作用及其调控机制。通过高通量测序、RNA-ISH、IHC以及多种分子生物学实验方法，研究团队发现circ1662在CRC组织中的表达显著高于相邻正常组织，并且与CRC患者的预后不良和肿瘤深度相关。进一步的研究表明，circ1662通过结合并促进YAP1核定位，从而促进了CRC的转移。同时，研究团队还发现了METTL3通过m6A修饰诱导circ1662表达的新机制，以及METTL3通过circ1662/YAP1/SMAD3轴调控CRC转移的重要作用。

本研究的结果不仅为CRC转移机制提供了新的见解，也为CRC的预后和治疗提供了新的标志物和潜在靶点。circ1662的高表达与CRC患者的预后不良相关，提示circ1662可能成为CRC预后的新标志物。同时，METTL3和circ1662在CRC转移中的重要作用，也为CRC的治疗提供了新的潜在靶点。未来的研究可以进一步探索circ1662和METTL3在CRC中的调控机制，以及针对这些靶点的治疗策略。

结论

本研究揭示了METTL3诱导的circ1662通过加速YAP1核定位促进CRC细胞侵袭和迁移的新机制。这一结果不仅为CRC转移机制提供了新的见解，也为CRC的预后和治疗提供了新的标志物和潜在靶点。circ1662有望成为CRC转移的新型预后和治疗标志物，为CRC患者的治疗带来新的希望。