采用间接ELISA法测定抗血清效价的分析研究

采用间接ELISA法测定抗血清效价的分析研究

ELISA分析：采用间接ELISA法检测兔抗蚌热休克蛋白血清效价

实验步骤：

1. 包被：使用pH 9.6、浓度为0.05 mol/L的碳酸盐缓冲液，将纯化的重组热休克蛋白稀释至20 μg/mL，并包被于酶标板上，每孔加入100 μL。将酶标板置于4℃条件下包被过夜。

2. 封闭：次日，向每孔加入100 μL 5%的脱脂奶粉，于37℃条件下封闭1小时。封闭完成后，使用pH 7.4的PBST洗涤酶标板3次。

3. 加样：向每孔加入200至51200倍稀释的兔抗血清100 μL。阴性对照为1:50倍稀释的免疫前血清，空白对照为兔抗血清稀释液（PBS）。每份样品均做1个平行样。将酶标板置于37℃条件下孵育1小时，然后同上洗涤3次。

4. 加酶标抗体：向每孔加入100 μL HRP标记的羊抗兔IgG，于37℃条件下孵育1小时。孵育完成后，同上洗涤3次。

5. 显色：向每孔加入100 μL TMB显色液，于37℃条件下避光反应20分钟。反应完成后，向每孔加入50 μL 2 mol/L硫酸终止液。

6. 读数：在酶标仪上测定450 nm波长下的OD值。

ELISA分析结果：

根据间接ELISA法的判定标准，当（样品吸光值-空白吸光值）/（阴性吸光值-空白吸光值）> 2.1时，判定为阳性。经过计算，本研究制备的兔抗血清效价为1:12800。

间接ELISA操作流程

一、实验准备

• 包被抗原：使用0.1 mol/L的碳酸盐缓冲液将包被抗原稀释至工作浓度。
• 洗涤缓冲液：PBST（1×PBS + 0.1% Tween 20）。
• 封闭液：1.5%明胶或10%小牛血清溶于1×PBS中。
• 血清样品：按所需比例稀释。
• 酶标二抗：按说明书稀释于1×PBS中。
• 显色液：由OPD、H2O2和底物缓冲液组成。
• 终止液：2 mol/L H2SO4。

二、操作步骤

1. 包被：
   • 将稀释后的包被抗原每孔加100 μL至酶标板中。
   • 37℃孵育1小时后，放入4℃冰箱过夜。
   • 弃去孔内液体，用PBST洗涤缓冲液洗涤3次，每次3分钟。
2. 封闭：
   • 每孔加200 μL封闭液（选择1.5%明胶或10%小牛血清）。
   • 37℃温箱放置1小时后，洗涤。
3. 加血清样品：
   • 将血清样品按百倍比稀释后，每孔加入100 μL。
   • 37℃温箱放置1小时后，洗涤。
4. 加酶标二抗：
   • 每孔加入1:1500稀释的HRP-羊抗鼠IgG（或按说明书稀释的酶标二抗）100 μL。
   • 37℃温箱放置1小时后，洗涤。
5. 显色：
   • 每孔加新鲜配制的TMB-H2O2底物液100 μL（或OPD显色液）。
   • 室温反应15分钟（或至阴性孔显色）。
6. 终止：
   • 每孔加终止液50 μL。
7. 读数：
   • 15分钟内用酶标仪于波长450nm处测定OD值。

三、结果判定

• 每块板同时设空白对照孔、阴性对照孔和阳性对照孔。
• 以待测孔的OD值大于或等于阴性对照孔的2.1倍（即P/N≥2.1）者，判为阳性。

四、抗血清效价测定

• 将抗原稀释于包被缓冲液中，终浓度为5 ng/μL，每孔加50 μL，并设立空白对照。
• 4℃包被过夜后，用PBST洗涤。
• 加封闭液封闭过夜后，洗涤。
• 加入一抗（血清样品按所需比例稀释），阴性孔加入阴性血清，空白孔加入样品血清作为对照。
• 37℃孵育后，洗涤。
• 加入酶标二抗，37℃孵育。
• 显色后，加入终止液。
• 在酶标仪上判读结果，根据阳性判定标准确定抗血清效价。

抗血清效价检测：间接ELISA法

实验目的：测定CDK7和cyclin H两种抗血清的效价。

实验材料：

• 纯化后的CDK7和cyclin H原核表达产物（作为抗原）。
• 未免疫的兔血清（作为阴性对照）。
• 免疫后的抗血清（作为一抗）。
• 辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG（作为二抗）。
• TMB显色液。
• H2SO4终止液。
• 酶标仪。

实验步骤：

1. 溶液准备：
   • 包被液：50mM Na2CO3（pH9.6），或根据需要使用其他浓度的包被缓冲液。
   • 封闭液：选择适当的封闭剂，如BSA、脱脂奶粉等。
   • 洗涤液：0.02-0.05% Tween-20的磷酸盐缓冲液（pH7.4）。
2. 抗原包被：
   • 将纯化后的CDK7和cyclin H抗原分别溶解于包被液中，调整至适当浓度。
   • 在两个反应板的对应孔中加入100μl抗原溶液，室温孵育2小时或4℃过夜。
3. 封闭：
   • 倒空孔内液体，拍干残留液体。
   • 用洗涤液清洗孔板两次，每次加入300μl洗涤液。
   • 在每个孔中加入300μl封闭液，孵育1小时。
4. 加一抗：
   • 倒空封闭液，拍干残留液体。
   • 用洗涤液清洗孔板两次。
   • 在每个孔中加入100μl一抗（免疫后的抗血清，按适当比例稀释），37℃孵育1小时或室温孵育3小时。
5. 加二抗：
   • 倒空一抗溶液，拍干残留液体。
   • 用洗涤液彻底清洗孔板，重复3次。
   • 在每个孔中加入100μl二抗（辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG），室温孵育1小时。
6. 显色与读数：
   • 倒空二抗溶液，拍干残留液体。
   • 用洗涤液彻底清洗孔板，重复多次以减少背景信号。
   • 在每个孔中加入100μl TMB显色液，显色30分钟。
   • 立即在405-410nm波长下使用酶标仪读取OD值。

注意事项：

• 实验过程中要确保所有溶液的纯净度和浓度准确性。
• 洗涤步骤对于减少非特异性结合至关重要，应彻底清洗孔板。
• 显色时间应根据实际情况调整，以获得最佳的信噪比。

实验结果：

• 根据读取的OD值，计算各稀释度抗血清的P/N值（样品OD值/阴性对照OD值）。
• 以P/N值≥2.1为阳性判定标准，确定抗血清的最高稀释度，即为该抗血清的效价。

ELISA实验基本原理

自1971年Engvall和Perlmann发表关于酶联免疫吸附剂测定（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）用于IgG定量测定的文章以来，这一技术已经从最初用于抗原定位的酶标抗体技术，发展成为一种用于液体标本中微量物质测定的方法。

ELISA的基本原理概述如下：

1. 固相化抗原或抗体：首先，将抗原或抗体结合到某种固相载体（如聚苯乙烯微量滴定板）的表面，并确保其在结合后仍然保持免疫活性。这样，固相载体就成为了免疫吸附剂。

2. 酶标抗原或抗体的制备：接下来，将抗原或抗体与某种酶进行连接，形成酶标抗原或抗体。这种连接产物既保留了抗原或抗体的免疫活性，又保留了酶的催化活性。

3. 免疫反应：在测定过程中，将待检测的标本（其中含有待测的抗体或抗原）与酶标抗原或抗体，以及固相载体表面的抗原或抗体，按照特定的步骤进行反应。这样，待测物质就会与固相载体上的抗原或抗体形成复合物。

4. 洗涤与分离：通过洗涤的方法，将固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他未结合的物质进行分离。

5. 酶促反应与定量：经过洗涤后，固相载体上结合的酶量与标本中待测物质的量成正比。此时，加入酶反应的底物，底物在酶的催化下被转化为有色产物。产物的量与标本中待测物质的量直接相关。因此，可以通过观察颜色反应的深浅来进行定性或定量分析。

6. 高敏感度：由于酶的催化频率非常高，这一方法能够极大地放大反应效果，从而使得测定方法具有很高的敏感度。

综上所述，ELISA是一种基于抗原抗体反应和酶促反应原理的微量物质测定方法，具有高敏感度和高特异性的特点。