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优宁维-IHC实验方案,难题解决之IHC/ICC实验设计

1056 人阅读发布时间:2014-04-09 10:57


      R& D Systems位于细胞生物学行业领先地位,2009年NATURE系列刊物就有790篇论文使用R&D Systems新闻图片1的产品。高质量的IHC抗体不仅提供低背景高信号的染色结果,而且可以反映组织生理学的真实结果。R& D Systems抗体交叉反应低,特异性高,保证了真实可靠的信号结果。

1. R&D Systems一抗的质量如何?
      为保障实验结果的可靠性,使用低交叉反应的高品质抗体。RD抗体主要采用活性重组蛋白作为免疫原,而不是人工合成的多肽。IHC/ICC抗体经过实验多重筛选及不同组织测试,避免了由于抗体的品质问题而导致的科研人员时间与样本的浪费,保证了真实可靠的信号结果。

2. R&D Systems一抗IHC应用区分石蜡和冰冻切片吗?区分IHCICC吗?
      R& D Systems抗体经过不同的细胞及组织材料的筛选,能特异性识别石蜡和冰冻切片中的抗原,IHC和ICC相互通用。

3.IHC/ICC, 选择单抗还是多抗?
      单抗和多抗的固有特性决定了其优劣势。单抗,由单个B细胞克隆产生的,具有高亲和力和针对单个抗原表位的特异性。如需检测具有相同氨基酸序列的蛋白家族,单抗就非常适合。单抗和抗原结合的效果取决于抗原能否保持其天然构象。但是抗原的构象一旦由于各种原因发生改变,如由于蛋白相互作用,翻译后修饰,温度,pH,固定,盐浓度等,单抗和抗原结合的效果会受到严重影响。
      由于多抗可以识别多个表位,不太受蛋白质构象变化的影响。一般来说,在一定的pH值和盐浓度范围内,多抗也比单抗更加稳定。基于这些原因,多抗比单抗更适合IHC/ICC实验。与其他公司多抗不同,R& D Systems有一类经抗原亲和纯化的多抗(货号以AF开头),该多抗通过抗原亲和柱的纯化提高了特异性,更加适合IHC/ICC实验。
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4.一抗试剂的孵育条件?一抗浓度,温度,时间?
      一抗抗体浓度,稀释,孵育时间和温度都会影响染色质量。这些变量需要针对不同抗体和样品进行优化,以达到高特异性,低背景的信号。一般的优化过程是,保持固定的孵育时间和温度,同时改变抗体的浓度以决定最佳的低噪音背景的信号。例如,使用一只高亲特异性抗体,可以使用相对较高的抗体浓度配套较短的孵育时间;或者,相对较低的抗体浓度配套较长的孵育时间。为促进特异性染色,常选用较长的孵育时间及较低温度下进行(如室温和4°C)。
      R&D Systems的染色优化方案: 对于组织切片,起始优化条件是4°C孵育过夜; 对于染色细胞,起始优化条件是室温孵育1小时。经抗原亲和纯化的多抗(1.7-15 ug/mL) 较单抗(5-25 ug/mL)的工作液浓度低。如使用不同浓度的同一抗体比较样本的染色效果,孵育时间和温度一定要一致。在实验室中使用新抗体时,建议进行预实验测试教广的抗体浓度。

一抗孵育的起始优化条件

样本 抗体
单抗 多抗
组织 5-25 ug/mL,4°C孵育过夜 1.7-15 ug/mL,4°C孵育过夜
细胞 5-25 ug/mL,室温孵育1小时 1.7-15 ug/mL,室温孵育1小时
优势 单抗原表位特异性 工作浓度低
劣势 易受抗原表位的变化影响 非特异性高,需经过抗原亲和纯化
 
 
5.做石蜡切片IHC,推荐什么抗原修复技术?
      背景知识:日常工作中所使用的10%福尔马林固定的石蜡包埋组织,经常产生蛋白交联反应遮蔽了组织内某些蛋白抗原,阻碍了抗原与抗体的结合。为了打开蛋白间的交联,使被封闭的抗原充分暴露,抗原修复技术在免疫组化操作过程中是个极其重要的环节,不同抗原修复方法直接影响免疫组织化学染色结果的表达。
      R&D Systems建议客户采用热修复的方法,并提供了高度优化的抗原修复试剂,有效修复抗原并提高免疫反应的效果:碱性抗原修复液(Catalog # CTS013), 酸性抗原修复液(Catalog # CTS014) ,中性pH 7.0抗原修复液(Catalog # CTS015) ,含有前3种修复液的综合修复液(Catalog # CTS016)。在R&D Systems的实验室中, 我们发现使用碱性抗原修复(Catalog # CTS013)容易取得良好的修复效果。
抗原未修复   抗原修复后
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人小脑组织Neuroplastin 65
一抗:3 μg/mL goat anti-human/mouse Neuroplastin 65 polyclonal antibody :Catalog # AF5360
抗原修复:Antigen Retrieval Reagent-Basic (Catalog # CTS013).
染色:Anti-Goat HRP-DAB Cell & Tissue Staining Kit (brown, Catalog # CTS008) and counterstained with hematoxylin (blue).
 
 6.如何做对照?
      合适的对照对解释IHC/ICC的结果的真实性是至关重要的。一个令人满意的IHC/ICC实验设计会有力显示抗原位于正确的特定组织,细胞类型,或亚细胞位置。我们推荐:Endogenous Tissue Background Control,No Primary Antibody Control,Isotype Control,Absorption Control,Tissue Type Control。

7.IHC,如何避免非特异性染色?如何选择染色试剂盒?
      所有IHC/ICC研究具体取决于抗体抗原结合,由疏水作用,离子相互作用,氢键结合以及其他分子间作用力等控制。然而,同样的引力也可能导致非特异性染色,即一抗结合了抗原表位以外的氨基酸。这是在IHC/ICC中是一个常见的问题。我们面临的挑战是减少非特异性相互作用,而不影响抗体的抗原表位结合。

       非特异性染色的原因包括一抗和二抗与和血清蛋白的相互作用,抗体和组织间的离子相互作用,能影响IHC检测系统的内源性分子的相互作用。这些问题可能导致高背景从而无法观察到目标蛋白的表达位置。通过使用阻断剂(a blocking reagent),可以修正非特异性染色体,而这些修正步骤都必须在一抗孵育之前完成。

封闭效果比较:

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内源性过氧化酶的影响
A. 未灭活内源性过氧化酶B. 使用过氧化酶灭活试剂处理15分钟

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石蜡包埋的人扁桃体组织CD14
A.未经动物血清封闭使用动物血清室温封闭15分钟
实验试剂:抗人CD14生物素化亲和纯化多抗(货号:BAF383,Sheep IgG),碱性抗原修复液(货号:CTS013),R&D Systems®高敏染色试剂盒(CTS019,Sheep Kit)
 
      R&D Systems®高敏IHC染色试剂盒(Cell and Tissue Staining Kit)是基于LSAB原理的高度优化试剂盒。高敏IHC染色试剂盒在原料上选用高特异性生物素二抗,高灵敏链酶亲和素链接酶(HS Streptavidin-HRP)。高灵敏链酶亲和素链接酶(HS Streptavidin-HRP)不与磷脂,核酸,及糖类结合蛋白结合,只与生物素化二抗节后,降低实验背景;染色试剂盒提供的4种封闭试剂(过氧化酶, 亲和素,生物素, 血清)能有效预防非特异性染色。
Molecule Species Description Cat. Number Size
HRP-AEC Goat Anti-Goat HRP-AEC Cell and Tissue Staining Kit CTS009 50 Tests
HRP-DAB Goat Anti-Goat HRP-DAB Cell and Tissue Staining Kit CTS008 50 Tests
HRP-AEC Mouse Anti-Mouse HRP-AEC Cell and Tissue Staining Kit CTS003 50 Tests
HRP-DAB Mouse Anti-Mouse HRP-DAB Cell and Tissue Staining Kit CTS002 50 Tests
HRP-AEC Rabbit Anti-Rabbit HRP-AEC Cell and Tissue Staining Kit CTS006 50 Tests
HRP-DAB Rabbit Anti-Rabbit HRP-DAB Cell and Tissue Staining Kit CTS005 50 Tests
HRP-AEC Rat Anti-Rat HRP-AEC Cell and Tissue Staining Kit CTS018 50 Tests
HRP-DAB Rat Anti-Rat HRP-DAB Cell and Tissue Staining Kit CTS017 50 Tests
HRP-DAB Sheep Anti-Sheep HRP-DAB Cell and Tissue Staining Kit CTS019 50 Tests
HRP-DAB Sheep Anti-Sheep HRP-DAB Cell and Tissue Staining Kit CTS020 50 Tests
 
优点
  • 即开即用
  • 高检测灵敏度
  • 适合冰冻切片,石蜡包埋切片,悬浮细胞等,
  • 适合细胞涂片(cytospin)(如淋巴细胞,单核细胞,转染细胞)
  • 适合多种一抗,如goat, mouse, rabbit, rat, sheep IgG.
组分
  • 4种封闭试剂(过氧化酶, 亲和素,生物素, 血清)
  • 高特异性生物素二抗
  • 高灵敏链酶亲和素HRP(HS Streptavidin-HRP)
  • DAB (褐色) or AEC (红色) 染料和缓冲液
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人胃癌石蜡切片Wnt-2
一抗:10 μg/mL 山羊抗人Wnt-2 亲和纯化多抗(货号AF3464).
抗原修复: 碱性热修复(货号CTS013).
染色:R&D Systems®高敏染色试剂盒(棕色,货号CTS008,Goat Kit) ;苏木精复染(蓝色).
实验方法:  IHC Enzymatic Protocol 1.0.
 
 8.ICC,如何选择荧光二抗?
      NorthernLights荧光抗体耐光漂白,明亮,是多色荧光显微的理想选择。他们的光谱接近几个常用的荧光染料,可与普通过滤器设备或激光器配套使用(见下表)。
优点
  • 明亮、不易褪色
  • 特异信号强
  • 在酒精和二甲苯中稳定
  • 应用于荧光显微镜(ICC)、免疫组化(IHC) 、流式细胞仪(Flow Cytometry) 等。
 
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NorthernLights Secondary Reagents Cat. # Abs/Em Maxima Laser (Ex) Fluorochromes with Comparable Spectrums (Abs/Em)
NL-493 anti-Sheep IgG NL012 493/514
 
Argon (488) FITC (492/520)
Cy™2 (489/506)
Alexa Fluor® 488 (494/519)
NL-493 anti-Rabbit IgG NL006
NL-493 anti-Mouse IgG NL009
NL-493 anti-Rat IgG NL015
NL-493 anti-Goat IgG NL003
NL-493 Streptavidin NL997
NL-493 anti-Chicken IgY NL018
NL-557 anti-Sheep IgG NL010 557/574
 
Krypton (568)
HeNe (543)
Phycoerythrin (565/575)
Rhodamine Red™ X (570/590)
Cy™3 (548/562)
NL-557 anti-Rabbit IgG NL004
NL-557 anti-Mouse IgG NL007
NL-557 anti-Rat IgG NL013
NL-557 anti-Goat IgG NL001
NL-557 Streptavidin NL999
NL-557 anti-Chicken IgY NL016
NL-637 anti-Sheep IgG NL011 637/658
 
HeNe (633) Allophycocyanin (645-660)
Alexa Fluor® 647 (650-668)
Cy™5 (650/670)
NL-637 anti-Rabbit IgG NL005
NL-637 anti-Mouse IgG NL008
NL-637 anti-Rat IgG NL014
NL-637 anti-Goat IgG NL002
NL-637 Streptavidin NL998
NL-637 anti-Chicken IgY NL017
 
9.DAB染色信号微弱,需要增强免疫染色?
      为更好的将抗原抗体结合的微弱信号进行有效的放大,使很多以前表达较弱的抗原加强染色效果;DAB 增强试剂Catalog # CTS010(浓度为50X ,3 mL)可以加强DAB 染色。使用DAB 增强试剂后, DAB 染色产生灰黑色的染色且背景低。
 
优宁维网站:www.univ-bio.com
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