优宁维之多色流式检测荧光分析技术资料

多色荧光标记在利用流式或荧光显微镜进行混合细胞免疫分群和单群细胞的多参数鉴定。那么多色流式实验时有哪些注意事项？应该怎样进行多色流式实验设计？

Tandem dyes是一类组合式的荧光素，通常由两种不同的荧光分子耦联结合而成。Tandem dyes能够提供更加宽广的荧光发射波长，由此增加了多色标记的选择性，比如常见的Tandem dyes如PE-Cy5、PE-Cy5.5、PE-Cy7、PerCP/Cy5.5、APC/Cy5.5 和APC/Cy7 等标记抗体。


多色流式检测荧光选择向导：

请依照我们的向导，带您选择最佳的多色荧光抗体：

1. 首先需要了解您的流式细胞仪，以确定哪些荧光可以在您的仪器上使用。

                请根据如下资料进行参考：荧光素参照表（可以在优宁维官网下载）
                BD multicolor_fluorochrome_laser_chart（可以在优宁维官网下载）

2. 了解不同荧光的荧光亮度

               请根据如下资料进行参考：荧光素参照表（可以在优宁维官网下载）
             BD Fluorochrome-Chart-Relative-Brightness （可以在优宁维官网下载）

3. 掌握一些荧光选择的基本原则：

1）尽量选择一些可以应用于您的流式细胞仪而又亮度高的荧光。例如BV421  PE作为最亮的荧光素而被首选。但如果所用的细胞样本具有很强的自发荧光时，不推荐使用PE；此时可以选择APC，也能产生最亮的荧光。

2）为表达量低的目标蛋白选择最亮的荧光，较弱的荧光可应用于高表达的蛋白检测。

3）所选择的荧光之间发射光谱重叠尽量小。一般来说，如果最大发射波谱相差越大，那么荧光重叠就越小；当然，这是由具体的荧光光谱特征决定的（点击此链接可查询荧光素光谱特征http://www.my-fcm.com.cn/gjsearb.asp）。 但是不推荐联用APC和CY5作为串联荧光染料，因为它们之间的光谱重叠较大，荧光补偿不易调节。

4）对比其他荧光来说，Tandem dye有可能发生解偶联，并且对光漂白和使用固定剂的固定时间更加敏感。因此通常情况下，建议设置一个Tandem dye单染作为对照，并在其他通道检测荧光情况，用以确保未发生解偶联。例如，应用PE-CY5单染作为对照，分析PE通道的荧光信号

5）应用FITC标记抗体时，避免使用酸性缓冲溶液，因为FITC的荧光特性是PH依赖的。
由于大部分荧光在强光下都易发生光漂白，所以荧光染色的样本避免暴露于强光下。

6）检测荧光染色样本后，建议尽快上机检测，最好是24小时之内。荧光染色的样本如果长时间放置，容易发生荧光丢失、污染、细胞降解等现象；当然，优势使用固定剂可以起到一定的保护作用，但是固定剂对Tandem dye产生不利影响。

表一：荧光素参照表(进入www.univ-bio.com可下载电子版)

在BD流式细胞仪上荧光素如何搭配为最优：

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