凋亡检测操作流程
三、JC-1检测凋亡细胞线粒体膜电位改变
BD™ MitoScreen (JC-1)线粒体膜电位检测试剂盒(551302):
| 组分 |
描述 |
| JC-1(染料) |
4瓶,每瓶用于25个样本。冻干粉,使用前稀释至储存液(Stock Solution),使用时稀释至工作液(Working Solution) |
| 10 x Assay Buffer |
60ml,足以用于100个样本。使用前稀释至1X |
试剂准备:
A.10× Assay Buffer的稀释(Assay Buffer作为实验的反应液用于清洗细胞) :
a) 使用前将10× Assay Buffer置于37°C水浴箱中至溶解。
b) 用双蒸水1:10稀释10× Assay Buffer,搅拌5分钟。
c) 使用前将1× Assay Buffer 在37°C预热。
JC-1储存液的配制(一瓶):
a) 室温下每瓶用125μl DMSO 稀释JC-1冻干粉。反复倒置混匀小瓶使JC-1充分溶解。
b) 储存液应立即稀释为工作液或分装成小份(避光操作),-20°C保存(可长达6个月)。
c) 避免反复冻融JC-1储存液。
JC-1工作液的配制:
a) 37°C预热1× Assay Buffer。
b) 用1× Assay Buffer 1:100稀释 JC-1储存液至JC-1工作液。例如将125μl的JC-1储存液加入12.375ml 预热的1× Assay Buffer中。 实验操作时,每个样本(<106细胞)需要0.5ml的JC-1工作液。
c) 轻柔混匀JC-1工作液待用。(混匀后可能会出现少许JC-1聚集微粒,但并不影响流式检测。也可在室温13,000g离心3分钟或 1,000g 离心15分钟去除JC-1团絮。)
实验操作:
- 制备1x106 /ml的细胞悬液, 浓度不宜过高,因为超过该浓度容易造成细胞的凋亡。
-
诱导细胞进行凋亡的处理,同时保留一份未经诱导的细胞作为对照。
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凋亡处理结束后,每个无菌的15ml聚苯乙烯离心管中加入1ml细胞悬液,室温下,400×g ,离心5分钟,弃上清。
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每管加入0.5 ml 新鲜配制的JC-1工作液,充分混匀后置于37°C的CO2培养箱,孵育10-15分钟。
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按以下步骤洗涤细胞两次:
第一次:每管加体积为2 ml的 1× Assay Buffer,轻轻悬浮细胞,振荡或用枪头使细胞分散,以免细胞聚集成块。400×g ,室温离心5分钟,弃上清。
第二次:每管加体积为1ml的 1× Assay Buffer,轻轻悬浮细胞,振荡或用枪头使细胞分散,以免细胞聚集成块。400×g ,室温离心5分钟,弃上清。
- 每管加体积为0.5 ml的 1× Assay Buffer,轻轻悬浮细胞,上机检测。
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