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2004 人阅读发布时间:2017-09-12 17:08
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能够方便而精确的对DNA和核苷酸序列进行编辑,是科研工作者们长期以来的梦想。CRISPR/Cas9系统的诞生和成熟标志这这一梦想逐渐变为现实。CRISPR/Cas9系统,作为第三代基因编辑技术,它的本质其实是细菌中一种对付诸如噬菌体等外来DNA的主动防御机制。此系统的工作原理是通过成簇的、规律间隔的短回文重复序列的crRNA( CRISPR-derived RNA )通过碱基配对与 tracrRNA (trans-activating RNA )结合形成 tracrRNA/crRNA 复合物,此复合物引导核酸酶 Cas9 蛋白在与 crRNA 配对的序列靶位点剪切双链 DNA。而通过人工设计这两种 RNA,可以改造形成具有引导作用的sgRNA (short guide RNA ),足以引导 Cas9 对 DNA 的定点切割,从而进行基因敲出等操作。本期小优专题之CRISPR/Cas9篇的第二部分将为您带来CRISPR/Cas9系统最为广泛的应用—基因敲除,以及优宁维中为您提供的相关产品与服务。
1.CRISPR/Cas9敲除质粒产品(产品链接)
产品说明:
①20 μg,可做20个转染体系;
②CRISPR/Cas9敲除质粒是一个包含三种编码Cas9核酸酶以及目标特异性的20 nt的向导RNA的质粒组成的,力求达到最高的敲除效率;
gRNA序列由GeCKO(v2)数据库设计,引导Cas9蛋白对目标基因组DNA进行位点特异性的切割,产生双链断裂;
CRISPR/Cas9敲除质粒支持人与小鼠的基因敲除应用,产品分别用名称后面的(h)与(m)标记区分;
提供纯化的质粒,可以直接进行转染实验。
图1. CRISPR/Cas9敲除质粒工作原理示意图
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2.同源重组修复(HDR)质粒(产品链接)
①HDR质粒特点:
HDR质粒提供了一个特异性的DNA双链断裂修复模板,只能与CRISPR/Cas9敲除质粒共转染使用;
当与CRISPR/Cas9敲除质粒共转染时,HDR质粒包含一个嘌呤霉素抗性基因,方便筛选存在Cas9诱导的DNA剪切的细胞。
②产品说明:
20 μg,可做20个转染体系;靶向特异的HDR质粒需与CRISPR/Cas9敲除质粒共转染使用,针对相同种属与靶基因。HDR质粒包含2到3个质粒,每个都包含一段与CRISPR/Cas9质粒切除位点附近序列一致HDR修复模板;每一个HDR模板包含两条800bp的同源臂,特异性的结合到相应的Cas-9介导的DNA双链断裂位点上下游;每一个HDR质粒插入了一段嘌呤霉素抗性基因,来辅助筛选稳定敲除的细胞;每一个嘌呤霉素抗性基因两侧都加入了LoxP位点,方便后期通过Cre载体切除;HDR载体也包含红色荧光蛋白,方便观察确认转染效率;提供纯化的质粒DNA,可直接用于转染。
图2. HDR质粒工作原理示意图
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3.Cre载体(货号sc-418923)
①Cre载体特点:
Cre载体表达Cre重组酶,一种噬菌体p1酶,能够催化两个LoxP位点间的DNA重组;
当CRISPR/Cas9敲除质粒与HDR质粒共转染后,包含编辑过的DNA的细胞可以被在HDR修复过程中插入的特异性标志物筛选出来;
在选择出来之后,细胞可以转染Cre质粒,将在HDR过程中插入进去的遗传物质切除掉,比如插入的嘌呤霉素抗性基因等。
②产品说明:
20 μg,可做20个转染体系;推荐用于对被筛选出的成功由CRISPR/Cas9敲除质粒与HDR质粒进行过基因编辑锅的细胞;提供纯化过的质粒,可直接用于转染。
图3. Cre载体工作原理示意图
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4.双切口酶质粒(产品链接)
①产品说明:
20 μg,可做20个转染体系;双切口酶质粒包括一对各自编码了一个带有D10A突变的Cas9核酸酶和一个20 nt向导RNA(gRNA)的质粒,在敲除目的基因时相对于CRISPR/Cas9敲除质粒具有更高的特异性;
一对gRNA序列识别位点彼此偏移大约20个碱基左右,特异性的Cas9调节的双切口酶对DNA进行切割,模拟基因组DNA的双链断裂;一对质粒其中一个含有嘌呤霉素抗性基因,方便药物筛选,而另一个质粒含有GFP标记物,方便观察确认转染效率;双切口酶系统支持人类与小鼠基因敲除应用,产品分别用名称后面的(h)与(m)标记区分;
提供纯化的质粒,可直接用于转染。
图4. 双切口酶工作原理示意图
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以上就是小优为您介绍的CRISPR/Cas9在基因敲除应用中涉及的产品,不知道大家是不是对利用CRISPR/Cas9这把锋利的“基因魔剪”进行基因编辑更加有信心了呢?科研路上,小优陪伴,优质产品,助力科研。
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