【小优带你读文献】重组人胰岛素表达和纯化

糖尿病是以慢性高血糖为特征的代谢性疾病，由胰岛素分泌缺陷或者作用缺陷所引起，可以分为I型糖尿病和II型糖尿病。胰岛素给药仍然是糖尿病药物治疗的重要方法。今天我们就通过一篇文献来看一下重组人胰岛素的表达和纯化吧。
 
人胰岛素是人胰岛的β-细胞产生的激素，主要作用的调节葡萄糖代谢。人胰岛素是一个分子量为5808Da的多肽。胰岛素包含两个肽链，肽链A（21个氨基酸）和肽链B（30个氨基酸），中间由两个二硫键桥连接。另外，肽链A还包含了一个链内二硫键。

 
胰岛素结构示意图
 
胰岛素的纯化过程主要分为：质粒构建，细胞培养，包涵体分离，包涵体溶解，复性，纯化等过程。步骤流程见下图：
 
下面小编就带大家来一起看一下文章中的具体步骤吧。
 

01质粒构建
 
人胰岛素基因的合成主要遵循以下原则：L-B-X-A。L是指先导肽，B是指人胰岛素链B，X是指连接链B和链A的Lys-Arg短肽，A是指人胰岛素链A。使用的质粒是pIBAINS，总共4354bp。质粒构建如下：
 
02细胞培养
 
质粒构建好之后转染到E.coli 20菌株中，在50ml GMS培养基中30℃培养18h，直到600nm吸光值达到0.5-1.0。然后转到7.5L发酵罐中扩大培养。
 
03分离包涵体
 
15000xg，15min，4℃离心收集细胞，细胞用裂解液悬浮（50 mM Tris-HCl pH 8.0, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.043% lysozyme），室温搅拌30min，然后加20ml Triton X-100 搅拌10min。细胞用高压均质器裂解，然后18400xg，4℃离心15min。沉淀用50 mM Tris-HCl pH 8.0, 500 mM NaCl and 1% Triton X-100洗涤，18400xg，4℃再离心15min。然后，沉淀用50 mM Tris-HCl pH 8.0, 500 mM NaCl buffer洗两次。最后，15,000 x g ，4℃，离心15min得到包涵体。
 
04包涵体溶解
 
包含胰岛素的包涵体用12mM NaHCO3和0.2mM EDTA溶解。PH用NaOH调为11.9，搅拌45min。然后用HCl把PH调节为10.8。最后24000xg，4℃，离心15min，去除不溶解的杂质。
 
05复性
 
溶解之后，通过18h的搅拌和通风进行复性。复性之后，用HCl把PH调节为9。
 
06胰岛素纯化
 
胰岛素前体用柠康酸酐处理，来形成胰岛素并且防止胰岛素降解。然后胰岛素纯化采用了3步纯化法，弱阴离子交换层析——强阴离子交换层析——反相层析。先用DEAE阴离子交换层析柱进行初步纯化，然后用Q阴离子交换层析柱进行中度纯化，再用RP-HPLC反相层析柱进行精细纯化，最后再用sephadex G-25脱盐柱进行缓冲液置换。
 
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相关文献
【1】Zieliński, Marcin, Romanik-Chruścielewska, Agnieszka, Mikiewicz D, et al. Expression and purification of recombinant human insulin from E. coli 20 strain[J]. Protein Expression and Purification, 2019, 157:63-69.
【2】P. Borowicz, A. Płucienniczak, J. Mikołajczyk, T. Głąbski, D. Kurzynoga, D.Mikiewicz-Syguła, et al. New insulin analogs of prolonged activity. European Patent Application EP 2321344A2, 2009

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