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374 人阅读发布时间:2021-10-27 15:51
II型cGMP依赖性蛋白激酶直接抑制胃癌细胞的HER2活化

点突变原理

先前的研究证明II型环状鸟苷单磷酸(cGMP)依赖性蛋白激酶(PKGII)抑制表皮生长因(EGF)诱导的表皮生长因子受体(EGFR)的磷酸化/激活。由于人类表皮生长因子受2(HER2)具有与EGFR相似的分子结构,此文章的目的是研究PKG II是否也抑制HER2活化。
用编码PKG II(Ad-PKG II)cDNA的腺病毒构建体感染人胃癌细胞HGC-27,以增加PKG II的表达,并用8-鸟苷-3',5'处理环一磷酸酯(8-pCPT-cGMP)激活激酶。进行蛋白质印迹以检测HER2的酪氨酸和丝氨酸/苏氨酸磷酸化。进行了共免疫沉淀实验以确定PKG II和HER2之间的结合。另外,使用QuikChange Lightning 定点诱变试剂盒将HER2的苏氨酸686突变为谷氨酸或丙氨酸。
结果
结果表明,EGF处理增加了HER2的酪氨酸磷酸化(激活)。通过感染Ad-PKG II和用8-pCPT-cGMP刺激来增加HGC-27细胞的PKG II活性,可以抑制EGF诱导的酪氨酸磷酸化/激 HER2。PKG II直接与HER2结合并引起苏氨酸686的磷酸化。当HER2的苏氨酸686突变为丙氨酸时,PKG II无法将其磷酸化,从而消除了PKG II对HER2活化的抑制作用。当HER2的苏氨酸686突变为谷氨酸,模仿该位点的磷酸化时,用EGF处理对突变体HER2的酪氨酸磷酸化/激活没有刺激作用。

苏氨酸686的磷酸化与HER2激活有关。用编码WT HER2,苏氨酸686-谷氨酸突变体HER2 (T686E)和苏氨酸686A-丙氨酸突变体HER2 (T686A)的cDNA的质粒转染HGC-27细胞。转染后第2天,将细胞用Ad-LacZ或Ad-PKG II感染过夜,血清饥饿12小时。随后,将细胞用8-pCPT-cGMP 处理1小时,然后与EGF孵育10分钟。将细胞的裂解物进行蛋白质印迹以检测HER2 的酪氨酸磷酸化/激活。结果表明,在用T686E质粒转染的细胞中,EGF处理不会引起HER2的酪氨酸磷酸化,表明HER2的苏氨酸686磷酸化模拟物可以抑制HER2的活化。在用T686A 质粒转染的细胞中,PKG II不能抑制HER2的活化,也不能使T686上的HER2磷酸化,这表明PKG II诱导的HER2的苏氨酸686磷酸化对于抑制HER2至关重要。
结果代表了三个独立的实验。HER2,人表皮生长因子受体2;EGF,表皮生长因子;WT,野生型;PKG II,II型cGMP依赖性蛋白激酶;Ad,腺病毒;Ad-LacZ,β-半乳糖苷酶;Ad,腺病毒;IP,免疫沉淀。
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