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点突变试剂盒的文献应用案例

374 人阅读发布时间:2021-10-27 15:51

II型cGMP依赖性蛋白激酶直接抑制胃癌细胞的HER2活化

新闻图片1

点突变原理

新闻图片2

先前的研究证明II型环状鸟苷单磷酸(cGMP)依赖性蛋白激酶(PKGII)抑制表皮生长因(EGF)诱导的表皮生长因子受体(EGFR)的磷酸化/激活。由于人类表皮生长因子受2(HER2)具有与EGFR相似的分子结构,此文章的目的是研究PKG II是否也抑制HER2活化。

用编码PKG II(Ad-PKG II)cDNA的腺病毒构建体感染人胃癌细胞HGC-27,以增加PKG II的表达,并用8-鸟苷-3',5'处理环一磷酸酯(8-pCPT-cGMP)激活激酶。进行蛋白质印迹以检测HER2的酪氨酸和丝氨酸/苏氨酸磷酸化。进行了共免疫沉淀实验以确定PKG II和HER2之间的结合。另外,使用QuikChange Lightning 定点诱变试剂盒将HER2的苏氨酸686突变为谷氨酸或丙氨酸。

结果

结果表明,EGF处理增加了HER2的酪氨酸磷酸化(激活)。通过感染Ad-PKG II和用8-pCPT-cGMP刺激来增加HGC-27细胞的PKG II活性,可以抑制EGF诱导的酪氨酸磷酸化/激 HER2。PKG II直接与HER2结合并引起苏氨酸686的磷酸化。当HER2的苏氨酸686突变为丙氨酸时,PKG II无法将其磷酸化,从而消除了PKG II对HER2活化的抑制作用。当HER2的苏氨酸686突变为谷氨酸,模仿该位点的磷酸化时,用EGF处理对突变体HER2的酪氨酸磷酸化/激活没有刺激作用。

新闻图片3

苏氨酸686的磷酸化与HER2激活有关。用编码WT HER2,苏氨酸686-谷氨酸突变体HER2 (T686E)和苏氨酸686A-丙氨酸突变体HER2 (T686A)的cDNA的质粒转染HGC-27细胞。转染后第2天,将细胞用Ad-LacZ或Ad-PKG II感染过夜,血清饥饿12小时。随后,将细胞用8-pCPT-cGMP 处理1小时,然后与EGF孵育10分钟。将细胞的裂解物进行蛋白质印迹以检测HER2 的酪氨酸磷酸化/激活。结果表明,在用T686E质粒转染的细胞中,EGF处理不会引起HER2的酪氨酸磷酸化,表明HER2的苏氨酸686磷酸化模拟物可以抑制HER2的活化。在用T686A 质粒转染的细胞中,PKG II不能抑制HER2的活化,也不能使T686上的HER2磷酸化,这表明PKG II诱导的HER2的苏氨酸686磷酸化对于抑制HER2至关重要。

结果代表了三个独立的实验。HER2,人表皮生长因子受体2;EGF,表皮生长因子;WT,野生型;PKG II,II型cGMP依赖性蛋白激酶;Ad,腺病毒;Ad-LacZ,β-半乳糖苷酶;Ad,腺病毒;IP,免疫沉淀。

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产品 用途 货号
QuikChange 突变
QuikChange Lightning Multi 最多可同时进行三处突变,10 或 30 个反应/试剂盒 210516, 210513
QuikChange Lightning  单点突变,10 或 30 个反应/试剂盒  210518, 210519
QuikChange HT 蛋白质工程系统
QuikChange HT  用于靶定蛋白质中多达 10 个不同的 50 个氨基酸长度的区域 G5900A
QuikChange HT  用于靶定蛋白质中多达 20 个不同的 50 个氨基酸长度的区域 G5900B
QuikChange HT  用于靶定蛋白质中多达 10 个不同的 67 个氨基酸长度的区域 G5901A
QuikChange HT  用于靶定蛋白质中多达 20 个不同的 67 个氨基酸长度的区域  G5901B
随机突变
GeneMorph II 平衡随机突变的突变聚合酶  200550, 200552

 

 

 

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