Nature子刊：一种用于生成研究及治疗用途的多巴胺能神经元的新方法

人类多能干细胞(hPSCs)是一种能够分化成为任何一种具有自我更新能力的细胞类型，在研究和治疗方面都有巨大的潜力。 当打算将这些细胞在治疗环境中使用这些细胞时，需要一种能量化的具有一致性的良好生产规范(GMP)标准。 

由Jisun Kim博士和哈佛医学院的团队领导的一项新研究发表在《Nature protocols》杂志上，提出了一种新的方案，可以在一个“点（spot）”中(一个小的、封闭的区域)而不是传统的二维单层膜中培养和分化hPSCs1。该持续28天的实验方法可以产生丰富的中脑多巴胺祖细胞(mDAPs)和中脑多巴胺神经元(mDANs)，是研究和治疗的理想选择。

该方案已经在帕金森氏症(PD)的研究中取得了成功，该疾病的病理特征之一是黑质致密部中脑多巴胺能(mDA)细胞的丢失，这使得细胞替代疗法具有诱人的前景。

最近，研究人员在帕金森病的临床前小鼠模型中使用了这种“spotting”的方法，移植了mDAPs的研究样本恢复了运动功能2。更令人兴奋的是，该方案首次应用于不需要免疫抑制剂的散发性PD患者的自体细胞替代治疗;祖细胞植入18-24个月后，患者PD症状稳定或改善3。

将hPSCs分化成mDA

在一个6cm的培养皿上，将1 × 104的 hPSCs在6个10 μl的spot上培养。 在28天内，细胞经历了三个阶段分别是:floor plate(FP)、neural progenitor(NP)和mDAP/mDAN阶段。
 
FP和NP阶段后，细胞在第15天进行单层培养，以避免细胞过度堆积，并允许继续分化。 FP和NP阶段包括添加信号化学物质的组合，如LDN、FGF8和CHIR，而BDNF和GDNF等神经营养因子则在最后的mDAP/mDAN阶段添加。  
 

图1. Schematic overview of the spotting method for mDA differentiation from hPSCs. a.hPSCs向mDA分化过程中spot周围的物理和化学环境。 b.受时间控制的mDA分化阶段总结。分化过程包括FP诱导、NP诱导和mDAP/mDAN诱导阶段。第15天进行细胞再生以避免细胞浓度过高。根据不同的应用，mDAPs可以被冻结用于移植。

与传统方法相比，spotting的方法明显减少了培养基的酸化。且能够更有效地生成mDA细胞，即时是在不良的培养条件下，此方法导致的细胞脱落相关的细胞损失要少得多(图3)。值得注意的是，由于严重的细胞损失，几乎90%的传统2D单层法的尝试在第28天都无法提供有意义的数据，而spotting法大多成功，且其产生的mDA细胞比传统的二维单层培养法更健康(图2b)。

图2. Morphological changes in cells during the process of differentiation of mDA from hPSCs.

 a.不同分化天数下(1-28天)的明视野镜检结果。 右图显示了细胞培养的示意图。培养第10天，单层培养的培养液pH显著低于spotting培养的细胞(pH 5.9 vs 7.9)。红色箭头表示细胞具有三角形的形态，表示具有非神经元异质表型的未分化细胞群。 白色箭头表示具有神经元形态的细胞。Scale bars,100μm。 b. Spotting和单层培养方法到第28天时的培养成功率(来自4个不同的研究人员的30次不同的实验)。 Spotting法显示了H9 hESC和C4 hiPSC的成功率均高于单层培养法。

图3. Cells’ survival and yield during the mDA differentiation process: comparison between spotting and monolayer methods for H9 hESC and C4 hiPSC.  

在第12和14天使用FACS测量总细胞损失/输入细胞数，如参考文献10所述，在第15天细胞复制前测量总细胞产量/输入细胞数。 b、细胞损失率与细胞产量之比表明，斑点培养法的细胞损失率与细胞产量之比明显低于单层培养法。 c，死亡细胞百分比在第15天最后收获时测定。 d - f, tunel阳性细胞(d)， cleaved caspase-3阳性细胞(e)和细胞死亡相关基因的RNA表达(f)被测量来代表细胞在第15天的状态，如参考文献10所述。 *P < 0.05 

最终在第0天和第28天通过关键mDA标记的免疫细胞化学，以及通过TH+、ALDH1A1+和GIRK2+的免疫荧光共同染色来表征细胞表型(APC-006, Alomone Labs )。
 

图4. Characterization of mDA cells differentiated from hESCs (H9) in vitro and in vivo.

图4b，将10万个细胞移植到单侧6-OHDA-lesioned损伤的胸腺大鼠纹状体26周后，移植的A9-多巴胺能神经元TH+、ALDH1A1+和GIRK2+免疫荧光共染色。图4c，移植物源性hNCAM+神经支配宿主脑的研究概况。图4d，移植物源性TH+神经元神经支配。 Scale bars 100μm。 

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参考文献：
Kim, J. et al. Spotting-based differentiation of functional dopaminergic progenitors from human pluripotent stem cells. Nat. Protoc. 1–25 (2022) doi:10.1038/s41596-021-00673-4.

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