二代测序（NGS）质控要点解析

二代测序（NGS）是基于PCR和基因芯片技术，由一代测序发展而来的，可以平行测序的技术，具有通量高，速度更快的优点。在进行NGS实验时，需要把样本DNA提取之后，在进行建库，然后上机测试，最后获得数据后，进行生信分析。在测序整个流程中，对于样本质量的要求非常高。低质量的DNA以及建库产物，会影响到文库转化率，测序的深度，复杂性和均一性等指标。所以测序做的好不好，质控很重要。

图 1 NGS建库和质控流程示例

安捷伦质控仪器，例如2100生物分析仪，Tapestation系统和片段化分析仪等，均可以对NGS全流程进行质控。今天鲁大师就带着大家看看NGS质控要点。

测序样本质控
· 基因组DNA
影响因素：储存条件，例如温度，储存环境、提取方法
安捷伦DIN值，数字化评判gDNA质控，使电泳图的解释更容易，便于样品的比较，并为NGS技术提供了实验的可重复性和高质量基因组DNA的定量

图 2 使用安捷伦gDNA ScreenTape assay 分析gDNA，DIN值越大，gDNA质量越好

· RNA
转录组测序的样本制备从提取RNA。RNA完整性对于下游建库和测序尤为重要。

图 3 使用片段化分析仪进行RNA 完整性分析. RQN为该仪器数字化评判RNA完整性的指标， RQN值越大，完整性越好。

RNA-seq cDNA合成
RNA-seq文库制备的一个重要步骤是将mRNA从总RNA中分离出来，并通过逆转录将其转化为cDNA(互补DNA)，用于后续的文库制备步骤和测序。

图 4 RNA-seq文库的制备步骤通过安捷伦片段分析仪系统进行QC。显示的是代表性步骤的电泳图：单细胞(A)cDNA扩增。(B)cDNA扩增作为阳性对照。(C)A为阴性对照，无细胞。(D)最终的NGS库

片段质量评估
目标DNA片段的大小是NGS文库构建的关键因素。对核酸进行片段化的方法主要包括物理打断和酶打断。物理方法包括声波剪切（和超声，酶切方法包括非特异性内切酶和转座酶片段化。根据需求，DNA片段长度可在150–800 bp之间。

图 5 PCR扩增子片段到350~500bp大小，以获得合适的测序样本。使用安捷伦片段分析仪系统来评估碎片化的程度。(A)非片段PCR扩增子在964bp。(B)超声打断 C和D重复超声打断技术，显示出广泛的片段模式，峰值约为390bp，是下游测序的理想选择

接头连接
片段化后的DNA需要加上接头。 接头其实就是一段已知的短核苷酸序列，用于链接未知的目标测序片段。接头添加方式不尽相同，但是接头连接情况，我们可以通过安捷伦质控仪器进行检测。

图 6 使用安捷伦Tapestation系统的进行接头连接的QC。(A)input DNA（红色）和接头（蓝色）示意图 (B)接头在75bp处有一个峰值 (C)input DNA在165bp (D)以B和C为参考，四个峰值：接头，input DNA,单端接头，双端接头 (E)加号接头的文库最终产物和(F)pcr后带有双端接头DNA插入片段示意图

文库最终产物质控
文库制备的最后一步是需要进行PCR扩增，从而富集接头连接的片段，产生足够的文库拷贝用于测序。良好的质控确保了高质量的文库准备，确定最终文库的大小、浓度和摩尔浓度。

两大影响因素：
· 接头二聚体
· 拷贝数大小

图 7 使用安捷伦生物分析仪进行NGS文库QC。(A)高质量文库 (B)接头二聚体约150bp的例子。

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