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qPCR反应之你问我答

904 人阅读发布时间:2023-01-30 09:54

实时定量PCR技术(real-time PCR)也叫qPCR(Quantitave PCR),是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程,最后通过特定数学原理对未知模板进行定量分析的方法。它是一项临床上非常成熟的技术,目前在分子生物学领域,qPCR核酸定量的shou选方法。目前仍在全球肆虐的新型冠状病毒鉴定的“金标准”——核酸检测就是通过qPCR原理进行的。
 新闻图片1

图1 qPCR技术原理简图
(图片来自henrik's lab)

 

那么拿到一个样本,需要经过以下多项操作流程才能定量检测到它的核酸含量。其中任何一个步骤操作失误都会导致它的检测结果出现异常,那让小爱来带您来看下出现常见问题的解答,为您解决qPCR实验中的痛点!

 新闻图片2

图2 qPCR实验操作流程图


FAQ:
1.  无Ct值出现
a)  检测荧光信号的步骤有误:一般染料法采用72℃延伸时采集,探针法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。
b)  引物或探针降解:可通过PAGE电泳检测其完整性。
c)  模板量不足:对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。
d)  模板降解:避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。
e)  反应循环数不够:一般都要在35个循环以上,可根据实验情况增加循环,但高于45个循环会增加过多的背景信号。
2.  Ct值出现过晚
a)  扩增效率极低:优化反应条件,尝试三步法扩增程序,或者重新设计引物。
b)  模板浓度太低:减少稀释度,重复实验。
c)  模板降解:重新制备模板,重复实验。
d)  PCR产物太长:一般将PCR产物长度设计为100 bp-200 bp之间。
e)  反应体系中存在PCR反应抑制剂:一般为加入模板时带入,导致模板质量不高,加大模板稀释倍数或者重新制备模板重复实验。
3.  阴性对照出现明显扩增
a)  反应体系组分(如水)被污染:实验过程中,更换新的Mix或者水重复实验。
b)  标本间的交叉污染或产物污染:反应体系在超净工作台内配制,对实验室进行严格的区分,减少气溶胶污染;使用带滤芯的枪头。
c)  引物二聚体的出现:引物设计不够优化:应避免引物二聚体和发夹结构的出现。
d)  引物浓度不佳:适当降低引物的浓度,并注意上下游引物的浓度配比。在35循环后阴性对照出现扩增属正常情况,可配合熔解曲线进行分析。
4.  熔解曲线出现多峰
a)  非特异性扩增。
b)  引物设计不佳:避免二聚体和发夹结构的出现。
c)  引物浓度不佳:适当调整引物浓度。 
d)  退火温度低:提高退火温度。 
e)  模板中有基因组DNA的污染:RNA提取过程中避免基因组DNA的污染(DNaseI处理),或通过设计引物避免非特异性扩增。
5.  出现引物二聚体
a)  优化扩增条件,如提高退火温度,可利用梯度PCR,摸索最佳的Tm值。通常两步循环(由95℃变性步骤直接进入60℃退火和延伸步骤)有利于强效扩增,因此引物设计时设定的成功退火温度为60°C。 
b)  引物浓度太高,适当降低引物浓度。
c)  可通过琼脂糖凝胶电泳确认引物二聚体。引物二聚体在凝胶的底部形成扩散条带,通常位于100 bp以下。
6.  扩增效率低
a)  反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解。 
b)  反应条件不佳:适当降低退火温度或改为三步扩增法。 
c)  反应体系中有抑制物:一般为模板中引入,应先把模板适当稀释,再加入到体系中,减少抑制物的影响。
7.  实验重复性差
a)  加样体积失准:使用性能较好的移液枪,扩大反应体积,将模板做高倍稀释,以大体积加入反应体系中。
b)  定量PCR仪不同位置温度控制不一致:定期校准仪器。
c)  模板浓度太低:模板浓度越稀,重复性越差,减少模板稀释度或提高加样体积。
d)  qPCR mix没有完全混匀,请使用前充分混匀。

除了实验操作的解答外,爱必信拥有全套qPCR解决方案来一站式帮您解决qPCR实验难题。
 

新闻图片3

 

表1 爱必信qPCR全套解决方案推荐产品

类别 货号 产品名称 规格
样本保存 abs9268 RNA样品保存液 100 mL
abs60330 RNA保护因子 50 T
RNA提取纯化 abs9331 Trizol(总RNA抽提试剂) 100 mL
abs60027 组织/细胞RNA快速提取试剂盒(Dnase I) 50 T
abs60030 病毒基因组DNA/RNA快速提取试剂盒 50 T
abs60028 植物RNA快速提取试剂盒(DNase Ⅰ) 50 T
abs60029 全血RNA快速提取试剂盒(Dnase I) 50 T
逆转录 abs60073 Reverse Transcriptase 10000U/10000U×5
abs60076 Plus All-in-one 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix (gDNA Purge) 50 T/100 T
abs60246 逆转录一管化三代预混液 100 T
qPCR abs60309 一步法超级多重荧光定量PCR试剂盒(探针) 100 T/250 T
abs60310 一步法超级荧光定量PCR试剂盒(探针) 100 T/250T 
abs60093 Multiplex Probe One Step qRT-PCR Kit 100 T/500 T
abs60086 SYBR High-Sensitivity qPCR SuperMix 1mL×5/1 mL×25
abs60087 SYBR qPCR SuperMix Plus(High ROX Premixed) 1 mL×5/1 mL×25
abs60088 SYBR qPCR SuperMix Plus (Low ROX Premixed) 1 mL×5/1 mL×25
abs60247 抗体染料法定量PCR预混液(通用ROX) 5×1 mL
abs60303 染料法荧光定量PCR试剂盒(化学修饰) 100 T/200 T/500 T
abs60304 染料法荧光定量PCR试剂盒(抗体修饰) 100 T/200 T/500 T
abs60305 探针法荧光定量PCR试剂盒 100 T/200 T/500 T
abs60306 UDG探针法荧光定量PCR试剂盒(防污染系统) 100 T/200 T/500 T
abs60307 超级多重荧光定量PCR试剂盒(探针) 100 T/200 T/500 T
abs60308 UDG多重探针法荧光定量PCR试剂盒(防污染系统) 100 T/200 T/500 T

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