标签蛋白纯化实战秘籍：GST标签纯化小技巧

1、原核表达用BL21菌株更合适？

BL21 菌株是 Lon 和 ompT 蛋白酶缺陷型菌株。Lon 是一种细胞内蛋白酶，ompT 是一种外膜蛋白酶，它们的缺失可以有效减少目的蛋白在细胞内的降解，从而提高 GST 标签蛋白的稳定性和产量。

2、蛋白表达如何优化？

培养的温度，增加通气性和优化诱导条件是考虑的改变项。例如，原核表达体系可以对IPTG诱导剂的浓度和诱导时间以及培养温度进行摸索。

3、PreScission，Thrombin和Factor Xa几种标签切割酶有什么区别？

（1）这几种内切酶的识别序列不同；

（2）PreScission可在4℃下酶切，且带有GST 标签，可通过GST 柱去除。Thrombin或Factor Xa更适合在室温条件酶切，酶切后可用苯甲脒的柱子 HiTrap Benzamidine FF 去除多余的酶。

（3）三种酶的酶切缓冲液不同，PreScission：50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, pH 7.5 at 5°C for 16 h。Thrombin：PBS at 22°C  for 16 h。Factor Xa：1 mM CaCl2, 150 mM NaCl, and 50 mM Tris-HCl (pH 7.5) at 22°C for 16 h

（4）在进行GST标签酶切时，应注意保证酶的用量和酶切时间，并且酶切应在合适的温度和酶切缓冲液中进行。

4、GST标签纯化有哪些小TIPS？

我们建议您在结合缓冲液和洗脱缓冲液中加入1-10mM DTT，以防止GST氧化聚集和还原型谷胱甘肽被氧化。
此外，在纯化时也要注意缓冲液的PH，结合缓冲液最适pH 6.5 – 8，洗脱缓冲液提高pH至8 – 9。
GST 结合动力学慢，目标蛋白结合较弱时可适当降低上样流速。

5、Glutathione Sepharose HP，FF，4B有什么区别，如何选择？

这3款填料都是Cytiva非常经典的GST标签纯化产品，三者的配基完全相同，但配基密度和填料骨架略有差异。其中4B这款产品的配基密度较高，载量也较高。具体参数见下图

6、GST填料如何进行清洗？是否可以耐受NAOH？

GST填料不耐受NAOH，0.5 MNAOH处理填料可导致填料配基完全失活。填料清洁可参考产品说明书。去除蛋白类的残留，推荐使用6 M盐酸胍。去除疏水类型的残留，可使用70%乙醇或者1% Triton X-100。