【小优细节君】内参蛋白平平无奇？聊聊WB的隐藏“大动脉”

我们的日常学习生活中常常存在一些关键但容易被忽略的存在，比如前阵子引发全网热议的裁员裁到大动脉事件……而在我们进行WB实验时，也有这样一个重要但不容易引起重视的存在：内参蛋白。今天，小优细节君就带大家来看一看WB实验中“大动脉”一般的存在。

内参蛋白也被称为参照基因或管家基因，是指在细胞或生物体的生命活动中持续表达、不随外界环境变化而发生显著改变的基因。在各组织和细胞中的表达相对恒定。在WB实验中内参既可以作为对照参考，也在结果分析中起到不可或缺的作用，我们也经常会遇到明明严格按照蛋白浓度调平了样本，WB结果却仍然出现内参条带深深浅浅的情况。这时，就需要结合内参蛋白的结果进行进一步的校准调平，避免误差。另外，内参蛋白还可以用于数据定量分析，通常会将目标蛋白的信号强度与内参蛋白的信号强度进行比值计算。这种计算方法能够更准确地反映目标蛋白在不同样品中的相对表达水平，排除由于实验条件和处理不同导致的干扰。

由于内参基因表达水平在不同样本或实验条件下相对稳定的特性，在实验中常常难以引起大家的重视，有时甚至会只检测目的蛋白而忽略内参。然而想要获得可靠的实验结果，合适的内参是必不可少的。那么如何检测出理想可靠的内参结果呢？可以从以下几个方面考虑：

1 表达水平

内参蛋白的表达水平并不是一成不变的，我们要尽量选择不受实验处理条件和样本类型影响的内参。Eaton等的研究发现，相比于对照组小鼠，β-actin和β-tubulin在SMA模型小鼠脊髓组织中的表达水平显著下调，并且β-actin在野生型小鼠的不同组织中表达水平也有显著差异[1]。同样的，在同一细胞样本中，不同的内参蛋白表达水平也会有差异[2]。因此在选择内参蛋白时要根据自己的实验样本及方案设计选择合适的蛋白作为内参。在进行实验时，可以多检测几组不同的内参蛋白，用于数据分析时的误差校正，对比选择更加可靠和适合的内参蛋白，以期获得可靠的结果。

以下是小鼠组织中，常见的几种内参蛋白表达水平：

Tab.1 不同小鼠组织中，内参蛋白的表达水平(来源于CST)

Fig.1 HT-29 cells中不同内参蛋白的检测情况

2 分子量

当需要同一张膜同时检测内参蛋白与靶标蛋白时，可以尽量选择与靶标蛋白分子量差距较大的内参蛋白。并且当检测样本为某种亚细胞结构等比较特殊的样本时，应注意内参蛋白的选择需要能够在检测的样本中具有稳定且较高的表达水平，方便后续实验的开展。以下为一些常用内参蛋白的细胞定位及分子量：

Tab.2 常用内参蛋白的细胞定位及分子量（来源于CST）

3 上样量

所选择的内参蛋白应与靶标蛋白均应保持在线性检测范围内[3]。理论上来说内参蛋白的信号强度与样本的上样量之间应该存在正相关的线性关系，然而在实际的实验研究中，我们发现当蛋白上样量达到一定水平后，内参信号强度的变化不再明显[4]，这种情况容易对后续的数据标准化处理和定量分析造成误差。一般来说，由于内参蛋白表达水平远高于靶标蛋白水平，在相同上样量的条件下，很有可能出现靶标蛋白信号较低或者内参蛋白高出线性范围，甚至由于信号过强出现反白条带或者膜上出现棕色条带等，因此选择和调整线性范围适合的内参蛋白十分重要。

Fig.2 不同蛋白上样量的内参信号强度变化水平

Fig.3 条带反白（来源于网络/CST）

4 辅助判断问题

内参蛋白可以说是WB实验最重要的结果了，可以提供很多辅助参考和帮助。如靶标蛋白无条带，可以先看一下内参蛋白的信号强度如何。若是内参信号也偏低，可以更换合适的内参或者增加上样量；若是内参出现疑似降解的杂带，则可以更换新鲜制备的样本，或者制样过程中尽可能避免蛋白降解。

很多同学来咨询WB问题，排查过程中我们就发现内参其实就不太理想，那么靶标蛋白就更难做出理想的结果了。所以做WB，务必首先做好内参，才能进一步分析目的蛋白，打好“地基”，才能建高楼。

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