【小优细节君】LC3 Western结果分析大揭秘！

LC3作为自噬标记物，是检测自噬必不可少的。我们之前的“【小优细节君】细胞自噬标志物LC3检测要点，必看！”中对LC3 的背景和Western检测要点有详细的介绍，感兴趣的小伙伴可以再去回顾一下。但仍有很多小伙伴对于LC3的结果分析不太明白，不知道怎么看。所以，今天我们就来具体讲解一下LC3的WB结果分析。

目前比较常用的统计方法有LC3-II/内参、LC3-II /LC3-I或LC3-II /（LC3-I+ LC3-II），那么我们该选择哪种方法才能准确量化自噬呢。别急，我们先来看几个典型条带，看完就明白了。

蛋白酶体抑制剂必不可少

例如下图1，很多小伙伴都是这样做的，对样本进行处理后检测LC3，然后通过LC3-II/LC3-I轻易地下结论说处理组自噬增加，这其实是不准确的。

图1  LC3典型结果

从图2我们看到，在样本处理的基础上加入溶酶体蛋白酶抑制剂处理后，出现了两种不同的情况，上面是LC3-II进一步增加，这才能表明处理组确实增加了自噬。下面的加了抑制剂之后，LC3-II蛋白水平不变，那么处理组LC3-II的表达增加可能是由于抑制自噬降解而导致自噬体积累，比如抑制自噬体-溶酶体融合，这两种得出的结论是完全不同的，所以我们必须通过联合蛋白酶体抑制剂处理才能更准确的下结论。

图2  加入蛋白酶体抑制剂后LC3结果

抗体的因素也不容忽视

在大多数情况下，抗LC3抗体检测LC3-II的灵敏度明显高于LC3-I，尤其是抗原表位位于LC3 N端的抗体。这主要是由于PE基团结合可能导致N端区域的构象变化，使得抗体对LC3-II的亲和性更高。因此LC3-II/LC3-I更容易出现增加的情况，在单个样本中的结论是不可靠的，并不能提示自噬是否激活和自噬状态。如图3，同样的样本使用不同的抗体LC3-II的表达明显不同，无法说明自噬的增加。同样的现象在Atg8中也观察到，Atg抗体对PE偶联的Atg8更敏感^[1]。

图3  PC12细胞使用单克隆抗LC3抗体（A）和针对LC3 N端的多克隆抗体（B）的检测结果

注意细胞培养条件

如果我们碰到下面不同细胞系的LC3对比图，如图4，那么我们可以得出结论，A细胞是自噬缺陷，其他细胞自噬增加吗？其实是不能的，因为这四种细胞都是在不同的培养体系中培养的，很多因素都可能会影响LC3的转化。即使是相同的培养体系，在培养过程中LC3-II也会波动。因此，要比较不同细胞之间的LC3-II含量是非常困难的，我们建议单独分析每个细胞系的情况^[2]。

有小伙伴要问了，如果我只做一种细胞，那是不是就没有这个问题了。这里也要注意，我们要在一个细胞周期内完成LC3的检测，否则也会出现很大的偏差。

图4 四种不同细胞LC3结果示例图

接下来，我们来看一个实际结果分析：

图5  MEF细胞LC3结果图

上图MEF细胞在短时间的饥饿处理下（0.5h和2h），LC3-I减少，LC3-II增加；而在长时间饥饿下（4h和6h），LC3-I和LC3-II含量都减少了。 如果按照之前的LC3-II /LC3-I，可能会获得4h，6h自噬更强的结论，但事实上并不是这样的，通过加入溶酶体蛋白酶抑制剂如E64d和pepstatin A处理，我们可以得出结论，在0.5h自噬是最强的，后面逐渐减弱。

总结

首先一定要有蛋白酶体抑制剂的结果，帮忙我们判断药物对自噬的影响方式。其次由于抗体因素，LC3-II比LC3-I更容易显出条带，涉及LC3-I的方法或多或少都不太准确，所以简单的反而更好，就是用样本间的LC3-II/内参直接进行比较。

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参考文献

[1] Ichimura Y, Imamura Y, Emoto K, et al. In vivo and in vitro reconstitution of Atg8 conjugation essential for autophagy[J]. J Biol Chem. 2004; 279(39): 40584-92.

[2] Mizushima N, Yoshimori T. How to interpret LC3 immunoblotting[J]. Autophagy. 2007, 3(6): 542-545