【小优细节君】PD标志物α-Syn蛋白的WB结果不尽人意怎么办？

你是否在Western Blot检测帕金森病（PD）标志物α-突触核蛋白（α-synuclein，α-Syn）时，总是遇到信号弱、背景高、结果不稳定的问题？别急，小优细节君今天带你揭秘如何通过多聚甲醛（PFA）交联技术，轻松提升检测灵敏度，让α-Syn的信号“亮”起来！

α-Syn是什么，为何难检测？

α-Syn在大脑和周围神经系统中积聚是PD的特征之一，它是PD的关键病理标志物，有低丰度和易脱落特性。α-Syn在Ser129处磷酸化呈高度毒性，导致多巴胺能神经元变性。神经元变性发生机制是一个活跃的研究领域。磷酸化α-Syn在PD病理中尤为重要，但其含量极低，常规方法难以捕捉。

传统WB方法中，因α-Syn单体（15 kDa）和磷酸化形式（如pSer129 α-syn）的分子量小、电荷特性或与膜的亲和力低，容易在洗涤步骤中从膜上脱落，导致信号弱或无法检测。

PFA和GA交联技术

——信号增强的“秘密武器”

PFA和GA作为化学交联剂，通过以下机制增强信号：

1 固定作用

PFA和GA与蛋白质的氨基（-NH₂）等基团反应，形成共价键，将蛋白质“粘”在膜上，减少洗涤时的流失。

2 中和电荷

α-Syn表面带正电荷，与膜（如激活后带正电基团的PVDF膜）结合较弱。交联剂可能中和电荷或增加疏水性，提升结合稳定性。

该方法已成功应用于细胞裂解液、脑组织样本及脑脊液（CSF）中α-Syn的检测。

小优细节君从Sensitive western blotting for detection of endogenous Ser129-phosphorylated α-synuclein in intracellular and extracellular spaces这篇文章中提炼了几点关键信息，分享给大家。

图1 不同浓度/时间PFA处理结果（α-syn）

①浓度依赖性：4% PFA显著增强总α-syn和Ser129磷酸化α-syn 的检测信号（1A）

②时间依赖性：4% PFA处理30分钟可最大化信号强度（1C）

③内源性检测：4% PFA使SH-SY5Y细胞内源性α-syn单体信号清晰可见（1B）

图2 不同浓度GA处理结果（α-syn）

①浓度依赖性：低浓度GA（0.001%~0.1%）增强α-syn信号，但高浓度（>0.1%）抑制信号（2A）

②特异性优化：不同抗体对GA的响应不同（2B）

图3 联合交联（PFA + GA）的协同效应

①信号增强：4% PFA联合0.01%~0.1% GA显著提升内源性Ser129磷酸化α-syn的检测灵敏度（3B）

②灵敏度提升：联合固定法检测重组α-syn的灵敏度提高10倍（3D）

③时间优化：联合固定30分钟为最佳处理时间（3C）

图4 不同浓度PFA/GA处理结果（其他蛋白）

·PFA和GA对其他蛋白（如SOD1、β-actin）的检测效果因分子量和抗体而异，需单独优化

注：图1-3中Syn-1、211、LB509代表不同的α-Syn抗体，EP1536Y、psyn#64代表不同的Ser129磷酸化α-syn抗体

应用建议

1、对低丰度蛋白，推荐使用交联剂（PFA+GA）预处理（注：此步骤添加转膜后、封闭前）。最佳条件为4% PFA + 0.01% GA处理30分钟。过高浓度（如8% PFA或1% GA）可能过度交联，掩盖抗原表位，降低抗体结合效率。

2、GA的强交联能力可稳定磷酸化表位，避免抗体识别受阻，尤其适合低丰度磷酸化蛋白。不同抗体对交联剂的敏感性不同，需根据目标蛋白特性来优化。

3、交联可能引入非特异性信号（如高分子量杂带），可通过siRNA敲除或磷酸酶处理验证目标条带。

PFA和GA通过化学交联增强蛋白质在膜上的保留，是提升WB灵敏度的有效手段。这一方法为神经退行性疾病（如帕金森病）中低丰度生物标志物的检测提供了新思路。

若遇到具体应用问题，欢迎与小优细节君一起交流探讨，望大家都能得到理想的结果！

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