GST标签蛋白纯化

谷胱甘肽S-转移酶（GST）

谷胱甘肽S-转移酶（GST）是一种源自日本血吸虫的酶，其分子量约为26,000 Da。在生物体内，GST主要负责催化谷胱甘肽与亲电子基团的结合反应，从而保护细胞免受氧化应激的损害。基于GST对谷胱甘肽的特异性结合能力，科学家们巧妙地将其开发为一种蛋白纯化标签。通过基因工程技术，将GST与目标蛋白融合表达，利用GST与谷胱甘肽配基的亲和介质特异性结合，实现目标蛋白的高效纯化。纯化过程中，首先在大肠杆菌等宿主菌株中构建含有GST标签的目标蛋白表达载体，诱导表达后裂解细胞，将裂解液与固定有谷胱甘肽的亲和介质（如琼脂糖凝胶）孵育，使融合蛋白与介质结合。随后，用适当的缓冲液洗涤，去除未结合的杂质蛋白。洗脱时，通过提高谷胱甘肽浓度或改变pH值，破坏GST与谷胱甘肽的结合，从而释放出融合蛋白。最后，利用特异性酶（如PreScission蛋白酶）切掉GST标签，得到天然目标蛋白。

GST融合蛋白纯化技术具有诸多优势。首先，纯度高，因为GST与谷胱甘肽的结合具有高度特异性，能够有效分离目标蛋白与杂质。其次，纯化条件温和，通常在接近生理条件的缓冲液中进行，有助于保持蛋白的天然构象和生物活性。此外，GST标签还能显著提高蛋白的可溶性表达，这是因为GST的分子结构富含亲水性氨基酸，有助于减少目标蛋白在表达过程中的聚集和沉淀。总的来说，GST融合蛋白纯化技术是一种高效、温和且实用的蛋白纯化方法，广泛应用于生物医学研究和蛋白生产领域。

常见问题

问：小优您好，想问一下柱上酶切怎么操作呢，能详细说一下嘛，我怕给柱子搞进气泡。

答： 柱上酶切是一种高效去除GST标签的方法，以下是针对不同规格GSTrap预装柱的具体操作步骤：

1ml GSTrap预装柱（结合8mg GST标签蛋白）：将80μl（1U/μl）Thrombin溶液与920μl PBS混合均匀。

5ml GSTrap预装柱（结合40mg GST标签蛋白）：将400μl（1U/μl）Thrombin溶液与4.6ml PBS混合均匀。

将上述Thrombin凝血酶混合物缓慢上样至柱内，确保柱子上端和下端用堵头封好，避免气泡进入。在室温（22-25℃）条件下孵育2-16小时，使酶切反应充分进行。

孵育结束后，移除柱子堵头，使用3ml（1ml预装柱）或15ml（5ml预装柱）的PBS缓慢冲洗柱子，并将流出液按0.5-1ml/管收集。此时流出液中主要包含切除标签后的目的蛋白以及Thrombin蛋白酶，而GST标签蛋白仍结合在柱子上。

为彻底去除残留的GST标签蛋白，需用5-10个柱体积的洗脱缓冲液进一步清洗柱子。随后，用5个柱体积的结合缓冲液冲洗柱子，最后充入20%乙醇保存，防止微生物滋生。

问：GST标签蛋白洗脱后切除怎么操作？

答： 洗脱液脱盐处理后，可直接加入适量蛋白酶进行孵育，具体操作如下：

收集洗脱液：柱下酶切后，收集洗脱液。此时洗脱液中已含有被释放的目的蛋白，而GST标签蛋白仍留在柱子上。

亲和层析去除GST蛋白：将洗脱液通过另一个亲和层析柱（如GSTrap柱），利用GST与亲和介质的特异性结合，捕获并保留GST标签蛋白，使目的蛋白流出。

洗脱目的蛋白：在亲和层析柱中，通过适当洗脱条件洗脱出目的蛋白，而GST蛋白则保留在柱子上。

根据实验需求，可进一步采用凝胶过滤、离子交换层析等方法对目的蛋白进行纯化，以提高其纯度和活性，满足后续实验要求。