TR-FRET/FRET排错圣经，一次解决90%翻车现场

FRET（Fluorescence Resonance Energy Transfer，荧光共振能量转移）实验是一种基于两个荧光分子之间距离依赖性能量传递的检测技术，常用于研究生物大分子之间的相互作用或构象变化。

TR-FRET（Time-Resolved FRET）是FRET的技术升级，通过引入时间分辨检测（Time-Resolved Fluorescence, TRF），解决了传统FRET中背景高、灵敏度低的问题，更适合复杂样品和高通量实验。

TR-FRET在药物研发流程中的应用

一、 在药物研发流程中的位置（从前到后）

1.靶点生物学与配体发现（Hit ID）：受体/酶配体结合或竞争结合、蛋白–蛋白相互作用(PPI)（适合可重组/可标记体系）

2.初筛（HTS）：端点型（结合/位点占有）或活性型（如磷酸化水平）板式读数，以 Z’、S/B、CV 评估稳健性，规模化筛库

3.命中确认（Hit Confirmation）：多重复+多点剂量反应，去除荧光体、金属螯合、表面活性引发的假信号

4.机理与选择性（MOA/Selectivity）：竞争/非竞争判别、变构征象、同系家族选择性、变位点蛋白交叉验证

5.细胞内目标占有（TE）/通路效应：细胞TR-FRET TE：带标记的可逆探针 + 目标蛋白（天然或标签化），量化细胞内 Kd/IC50(TE)

6.后期应用：QC放行

二、常见TR-FRET应用场景

1. 结合与占位（Biochemical / Cell-free）：供体标记靶蛋白（或抗体），受体标记示踪配体（tracer），供体和受体形成近邻，可以读出信号。

2. 酶活/通路活性（Kinase/Phospho、Epi等）：cAMP、生物标志物或被修饰底物（如磷酸化），用Eu/Tb抗体和受体标二抗/标签抗体形成近邻，供体和受体形成近邻，可以读出信号。

3. PPI/复合物结合：A供体+B受体；A–B结合，供体和受体形成近邻，可以读出信号。

4. PROTAC/分子胶（Ternary Complex）：E3供体+受体标记POI，加入双功能分子 ，组装三元复合体，供体和受体形成近邻，可以读出信号。

5. 细胞内Target Engagement（TE）：标签化靶蛋白（SNAP/Halo）+细胞可渗透受体标示踪配体；内源蛋白+抗体对（一抗Tb，二抗受体，形成夹心复合物，检测修饰/构象）。

三、 TR-FRET和其它技术的对比

四、如何快速选择检测方式

1、有酶标仪TR-FRET模块，选择TR-FRET，免洗、通量高、背景低、动态范围宽，是ELISA的“直接升级”。

2、需要灵敏度，选择化学发光/MSD更成熟，检测背景更低，可检测健康人的血液样本。

3、大分子复合物或极微量样本，选择AlphaLISA，可与TR-FRET互补。

4、想看实时动力学，选择SPR，只看终点/初筛HTS，选择TR-FRET成本和通量最佳。

TR-FRET实验常见问题解析

TR-FRET试剂盒虽然技术成熟、灵敏度高，但在实际使用中仍会出现问题。以下是问题、原因和办法的汇总，可作为日常排错清单直接对照。

1.信号弱 / S:B 低 /Signal Window ＜ 2

表现：受体/供体比值（Ratio = 665/620 × 10⁴）未伴随剂量浓度而明显变化。

可能原因

•  供受体距离/构型不佳；标记密度低或位点不合适

•  酶标仪时间门控不佳（Delay/Integration设置不匹配Eu/Tb寿命）

•  铕/铽供体荧光标记物过期、反复冻融或受光漂白

解决方案

•  直接读供体通道（620 nm 左右），若本身荧光低，说明供体失效，应更换

•  做阳性对照孔，验证仪器/试剂

•  优化时间门控Delay（50–150 µs）、Integration（100–400 µs）到 Z′ 最大 的区域；固定后不要随意变更

•  加 0.1% BSA/Casein + 0.01–0.05% Tween-20 提升稳定与抗吸附

2．信号波动大 / CV 高 / 板间漂移

可能原因

•  加样误差、微孔板边缘蒸发、孵育时间漂移、温度过高导致试剂失效

•  组件非特异吸附、聚集体干扰

•   酶标仪配置不佳，光栅类型酶标仪特异性不好

解决方案

•  使用板封膜，全程 20–22 ℃孵育，或把板子放在带湿盒的恒温箱

•  弃用外圈，改用 3 复孔内圈布局

•  加表面惰化（BSA/Casein）与少量表活；必要时改高亲水性板材

•  选择滤光片类型酶标仪

3．钩状效应（Prozone/Hook）/钟形曲线/高浓度反而信号降

解决方案：

•  整体下调抗体浓度，定位平台区；保持在线性上升区。

•  调整样本浓度（比如：细胞密度/上清液浓度/组织的量等），调至未达平台区为止

4. 平衡未达成 / 慢结合 / 无信号

解决方案：延长孵育，可过夜。

5. 特殊样本相关

•  血清/血浆/组织裂解液：信号低时，可延长时间或增加细胞浓度。

•  化合物干扰：带共轭芳香环、荧光素骨架的小分子常自发荧光，若 665 nm 信号随化合物递增，直接排除或降低浓度。

6.常见问题与快速排错

•  信号弱/S:B（信噪比）低：提高标记密度或选择更高量子产率受体；优化延时与积分窗。

•  漂移/批间差：固定读数时间线（加样→孵育→读数），板内“锚定”滴定孔做归一化除理。

•  化合物干扰：若665nm信号随化合物递增，直接排除或降低浓度。

•  非特异聚集：低盐+无表面活性环境下易出现假抑制，可以加0.01–0.05% Tween-20/Pluronic或加入0.1% BSA/Casein封闭。Buffer中有不溶沉淀是正常现象。

TR-FRET试剂盒推荐

Bioauxilium是一家总部位于加拿大蒙特利尔的专业研发和生产TR-FRET技术试剂公司，其研发人员在TR-FRET技术领域深耕30余年。来自加拿大,不受关税影响,货期稳定。Bioauxilium 在全球拥有诸多大型药物研发公司和CRO的用户，THUNDER™产品的卓越性能已经广泛得到TR-FRET用户的好评和青睐。

THUNDER™提供胞内磷酸化蛋白、总蛋白检测，GPCR相关第二信使cAMP检测，细胞因子及Biomarker检测，以及适合Assay开发的标签抗体（ToolBox抗体）试剂等。

（1）细胞因子&生物标志检测

Human IFNγ 为例

THUNDER细胞因子检测是基于双抗体夹心法，标记荧光供体和受体的IFNγ抗体Eu-Ab1和FR-Ab2，分别与细胞上清中IFNγ结合，产生能量共振转移FRET（615nm），进而产生665nm荧光信号，荧光信号强度与IFNγ浓度成正比。全程仅需2h，免洗，可高通量。检测灵敏度高，上限宽。

Human IFNγ检测范围：32 – 30,000 pg/mL

图：Human IFNγ检测原理，流程及标曲

（2）磷酸化蛋白检测

THUNDER磷酸化蛋白和总蛋白检测是基于双抗体夹心法，标记荧光供体和受体的蛋白抗体Eu-Ab1和FR-Ab2，分别与细胞上清中目标蛋白结合，产生能量共振转移FRET（615nm），进而产生665nm荧光信号，荧光信号强度与目标蛋白浓度成正比。以磷酸化ERK为例，全程仅需4.5h，免洗，可高通量。检测灵敏度高，上限宽。

图3. THUNDER磷酸化蛋白检测原理示意图

该试剂盒已通过验证，适用于HEK293、H358、MCF7和B淋巴细胞裂解液中磷酸化- ERK1 /2（T202/Y204）的相对定量。用EGF处理HEK293细胞（50000个细胞/孔）与不同梯度浓度的EGF在室温下孵育10分钟。数据显示，EGF促进ERK磷酸化。饥饿处理不同密度的H358细胞18个小时，用不同梯度浓度的RMC-4550在37℃下孵育60分钟。数据显示，RMC-4550可以抑制ERK1/2蛋白T202/Y204位点的磷酸化。用不同梯度浓度的L779,450处理不同密度的MCF7细胞，在37℃下孵育30分钟。数据显示，L779,450可以抑制ERK1/2蛋白T202/Y204位点的磷酸化。在不含血清的RPMI中重悬不同密度的B淋巴细胞，用不同梯度浓度的L779,450在室温下孵育30分钟。数据显示，L779,450可以抑制ERK1/2蛋白T202/Y204位点的磷酸化。

图. THUNDER Extreme Phospho-ERK1/2 (T202/Y204)验证数据

FRET实验速查与排错指南

一、实验设计四要点

1.荧光对选择

•  原则：良好光谱重叠（供体发射+受体吸收）+足够光谱分离（便于区分通道）+明亮/稳定。

•  常见思路：CFP/YFP系、mTurquoise2/Venus、mTFP1/mCitrine、GFP/mCherry、Alexa488/Alexa555/568 等染料对。

2.标记与构建

•  蛋白质FRET：连接位点、连接肽长度与柔性会影响距离/取向；尽量保留生物学功能，并做“拯救”或功能验证。

•  体外标记：位点特异（如半胱氨酸、SNAP/CLIP、HaloTag），定量化标记度（DOL）和供受体化学计量。

3.对照与标准品

•  供体单独、受体单独表达/标记；

•  正对照：已知能FRET的融合构建（如Donor–linker–Acceptor）；

•  负对照：断裂/突变型或分离构建（无FRET）；

•  若做定量，准备校正因子。

4.成像/仪器设置

•  方案A：敏化发射FRET（SE-FRET；常规荧光显微）；

•  方案B：受体光漂白FRET（AP-FRET；漂白受体后供体增强）；

•  方案C：寿命FRET（FLIM-FRET）。

•  单分子/总内反射、流式FRET、板式读数亦可按需求选择。

二、常见问题与定位思路（Checklist）

1.FRET信号很弱/没有

•  供受体距离>10 nm或取向不利 → 调整连接肽长度/柔性、改变标记位点；

•  光漂白过快/信噪低 → 降低光强、短曝光、使用更亮更稳的荧光团；

•  表达量失衡（受体过量或供体过量）→ 调整转染量/感染MOI，做化学计量优化；

•  受体未成熟/折叠慢 → 更换荧光蛋白版本（如mTurquoise2、mNeonGreen、mScarlet等）或延长培养时间；

•  体系确实不发生相互作用 → 做阳性对照验证。

2.假阳性/虚高

•  光谱串扰未除干净 → 用单标样本计算并应用到每次实验；

•  交叉激发严重 → 调整滤光片/激发波长，或选更分离的荧光对；

•  背景/自发荧光高 → 做背景区扣除，选低自发荧光培养基（如Phenol Red–free）；

•  光毒/漂白导致形态变化 → 优化光剂量与采集时长。

3.细胞内定位改变导致结果不可比

•  供受体融合改变了靶蛋白定位/功能 → 加入Linker优化、做功能学补救；

•  不同处理组表达水平差异巨大 → 正规化供体强度或用FLIM。

4.批间差/复现性差

•  每次都重做单标定标；

•  固定软件/拟合流程（保存脚本与参数），记录增益、激发功率、曝光。

5.FLIM拟合困难

•  寿命分布复杂（多指数） → 先做相位/调制法或拟合；

•  信噪不足 → 提高采集时间或做时间分箱；

•  漏拟合仪器响应函数（IRF） → 采 IRF 或用参照样品校正。

三、FRET技术应用

1. 生物学机制研究（细胞/分子尺度）

•  蛋白相互作用（PPI）/二聚化：Ras–Raf、NF-κB 亚基结合、受体酪氨酸激酶诱导二聚化。

•  构象变化（单分子或细胞内）：核糖开关折叠、动力蛋白步进、离子通道开关。

•   膜融合/囊泡运输：SNARE 介导融合、病毒入侵。

•  力学张力/粘度与拥挤度：整合素/肌动蛋白张力传感器、细胞质拥挤度探针。

2.活细胞信号传导与代谢

•  离子/小分子动态：Ca²⁺、cAMP、cGMP、葡萄糖/乳酸探针。

•  激酶/磷酸化事件：PKA、ERK、AKT。

•  蛋白水解/翻译后修饰：Caspase 活性、SUMO/Ub 相关构象变化。

3.核酸技术与分子诊断

•   qPCR 探针：SNP 分型、病原体定量

•   原位杂交（FRET-FISH）/核酸折叠：基因定位、二级结构动力学

4.高通量药筛 & 结合测定

•  TR-FRET（时间分辨 FRET）/HTRF：受体–配体结合、蛋白–蛋白/蛋白–核酸干预筛选

5.材料与纳米尺度“分子尺”

•  聚合物/纳米颗粒组装、DNA 折纸：纳米结构距离标定、能量传递网络

6.免疫分析与POC（床旁）方向

•  夹心免疫 FRET/近邻依赖：激素/药物/生物标志物定量

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