聚合酶链式反应（PCR）原理

About PCR 原理

1983 年，美国生物化学家卡里・穆利斯（Kary Mullis）在深夜驱车行驶于 128 号公路时灵光乍现，他在一张收据背面匆匆记下了这一构想 —— 正是这个想法，后来为他赢得了 1993 年的诺贝尔化学奖。这一概念的核心十分简洁：在实验室试管中复刻细胞内天然的 DNA 复制过程，最终以现有 DNA 链为模板，合成新的互补 DNA（cDNA）链，达成与生物体内一致的复制结果。

穆利斯的这项技术以桑格（Sanger）DNA 测序技术的核心原理为起点，他敏锐地意识到，通过重复利用 DNA 聚合酶，可触发连锁反应，实现特定 DNA 片段的指数级扩增。而这一设想的落地，离不开一种关键物质的发现。

早在 1976 年，中国台湾科学家钱嘉韵教授的团队从黄石国家公园温泉中的水生嗜热菌（Thermus aquaticus）体内，分离出了一种特殊的 DNA 聚合酶 ——Taq 聚合酶。这种酶最显著的特性是耐高温，即便在 95℃的高温下仍能保持活性，这与当时常用的普通聚合酶形成了鲜明对比。在此之前，分子生物学家虽已尝试开发循环扩增 DNA 的方案，却受制于技术瓶颈：DNA 变性（解链）所需的高温会使普通酶迅速失活，必须在每个循环中重新添加酶，操作繁琐且效率低下。Taq 聚合酶的热稳定性彻底解决了这一问题，让扩增过程实现自动化循环，无需反复补加试剂，大幅提升了效率并降低了操作复杂度。

1985 年，《科学》（Science）杂志首次发表了采用 Taq 聚合酶的聚合酶链反应（PCR）技术论文，正式宣告了这项技术的诞生。到了 1993 年，经 FDA 批准的 PCR 试剂盒正式推向市场，而穆利斯也在同一年登上了诺贝尔化学奖的领奖台。

自此以后，PCR 技术历经持续的系统优化，逐渐成为临床诊断、法医物证分析、疾病监测及基因工程等领域的革命性工具。它不仅能将微量 DNA 在数小时内扩增至百万倍以上，更彻底改变了生命科学研究与应用的范式，堪称 20 世纪生命科学领域最具里程碑意义的突破之一。

标准 PCR 实验概述

PCR 技术的核心功能，是从含有模板 DNA 的复杂起始材料中，特异性扩增出一段目标 DNA 片段。在实验启动前，样品的制备与纯化方案需根据起始材料特性调整 —— 既要考虑样品基质的差异，也要兼顾目标 DNA 的可及性。通常需将 DNA 提纯至满足扩增需求的最低浓度，且必须掌握待扩增片段（即目标 DNA）两侧的序列信息，这是 PCR 实验开展的基础前提。

从操作层面看，标准 PCR 实验流程相对简便，整个过程可在数小时内完成。一套完整的 PCR 反应体系，需包含五种关键试剂，各试剂的功能与特性直接影响扩增效果：

一、PCR 反应的核心试剂

模板 DNA（待扩增 DNA）

作为扩增的起始模板，其来源不受限制，常见的有基因组 DNA（gDNA）、经反转录获得的互补 DNA（cDNA），以及质粒 DNA 等。只要模板中含有目标序列，且纯度达标，即可用于 PCR 反应。

DNA 聚合酶

所有 PCR 反应均依赖能耐受高温的 DNA 聚合酶，其中 Taq 聚合酶是标准 PCR 中最常用的类型。它可在 70℃下以每秒 60 个碱基的速度连接核苷酸，能扩增长达 5kb 的模板，完全适配无特殊要求的常规实验。

随着技术发展，新一代聚合酶不断优化：部分酶被设计为仅在高温下激活，可减少反应初期的非特异性扩增；另有酶具备 “校对活性”，能修正碱基错配，在克隆等需保证扩增序列与模板完全一致的场景中至关重要。

引物

DNA 聚合酶无法自主启动合成，需依赖一段短核苷酸序列（即引物）定位起始位点。PCR 所用引物为 15~30 个碱基的单链 DNA，设计时需针对目标区域两侧分别构建正向与反向引物，确保特异性结合。

引物设计是实验成功的关键：需确保引物仅与目标序列结合，避免匹配相似序列；一对引物的熔解温度需接近（因退火步骤对两条链同步进行），而熔解温度受 GC 含量影响（GC 占比越高，熔解温度越高），可通过调整引物长度平衡这一差异；同时需避免引物自身形成二级结构或引物间形成二聚体（否则会降低扩增效率），目前有多种免费在线工具可辅助完成引物设计。

脱氧核苷酸三磷酸（dNTPs）

dNTPs 是合成新 DNA 链的 “原料”，包含 dATP、dCTP、dGTP、dTTP 四种基本核苷酸。为保障碱基结合效率最优化，dNTPs 通常按等摩尔比例加入反应体系。

PCR 缓冲液

缓冲液的作用是维持整个反应过程中的最佳环境，核心成分包括氯化镁（MgCl₂）、三羟甲 - 盐酸（tris-HCl）与KCl。其中，MgCl₂是 DNA 聚合酶的必需辅助因子，直接影响酶活性；tris-HCl 与 KCl 则共同维持反应体系稳定的 pH 值，确保酶促反应正常进行。

二、PCR 反应的核心过程：三步循环扩增

PCR 反应的实现，需将上述试剂混合后加入反应管，再放入 PCR 仪中执行 “变性 - 退火 - 延伸” 的循环流程（图 1）。每个循环包含三个温度与时间明确的步骤，通常重复 30~40 次，每次循环可使 DNA 数量翻倍，最终实现目标片段的指数级扩增

1. 变性：DNA 链解离

作为 PCR 的第一步，变性阶段需将反应体系加热至 95℃并维持数秒。高温会快速断裂模板 DNA 双链间的氢键，使双链解离为两条单链，为后续引物结合提供条件。

2. 退火：引物特异性结合

变性后，反应体系冷却 30 秒至 1 分钟，退火温度通常设定为 50~65℃（具体需根据引物的长度、序列优化，每套新引物均需单独调试最佳温度）。

此温度下，单链 DNA 虽有复性为双链的可能，但因体系中引物过量（远多于模板 DNA），引物会优先与模板 DNA 的互补区域结合（即 “退火”），形成模板 - 引物复合物。此时 DNA 聚合酶已准备好启动链的延伸。

3. 延伸：新 DNA 链合成

退火后，温度升高至 DNA 聚合酶的最适工作温度 —— 常规聚合酶约为 72℃，Taq 聚合酶则为 74℃。

DNA 聚合酶会结合到引物的 3’端，以模板 DNA 为参照，利用体系中的 dNTPs 合成新的互补 DNA 链。至此，初始的 2 条 DNA 链会变为 4 条，完成一次循环。

随后温度回升至 94℃，新合成的双链 DNA（含原始模板与新链）再次变性为单链，启动下一轮 “变性 - 退火 - 延伸” 循环。第二次循环结束后，单链 DNA 分子增至 8 条；重复 30 次循环后，初始的 1 条双链 DNA 可扩增为超过 1.3 亿条新双链分子，且每个分子均为引物退火位点所界定的目标区域副本。

三、PCR 产物的验证与下游应用

扩增结束后，需通过凝胶电泳验证结果：不仅能确认扩增子是否存在、判断其大小是否符合预期，还能估算产物的大致丰度。

对部分实验（如验证某基因是否存在）而言，凝胶电泳检测可能就是实验终点；而在测序、克隆等更复杂的下游研究中，PCR 产物则是后续分析的起始材料，为进一步探索基因功能、序列特征等提供基础。

不同类型的 PCR 技术概述

凭借高度的灵活性，PCR 技术在近年持续迭代，衍生出多种适配不同研究需求的技术类型。以下将围绕几类应用最广泛的 PCR 技术，解析其核心原理与特性：

一、定量实时 PCR（qPCR）

定量实时 PCR（简称 qPCR）是 PCR 技术中极具实用价值的分支，核心优势在于 “实时监测” 与 “准确定量”—— 它能在扩增过程中动态追踪 PCR 产物的生成，而非仅在反应结束后检测结果。

其定量原理依赖荧光信号的变化：

一种是加入 SYBR® Green 等非特异性荧光插层染料，这类染料仅与双链 DNA 结合后发出荧光；

另一种是使用序列特异性荧光探针（如水解型 TaqMan 探针、分子信标），探针两端分别连接荧光分子与淬灭剂，利用福斯特共振能量转移（FRET）原理，当探针与扩增子结合并被酶切后，荧光分子脱离淬灭剂释放荧光。

无论采用哪种方式，荧光强度都会随目标 DNA 拷贝数的增加成比例上升。通过与已知拷贝数的标准品对比，即可实时计算出样品中目标 DNA 的初始浓度，多数情况下可省去后续凝胶电泳验证的步骤

qPCR 需借助配备荧光检测系统的专用仪器，实现扩增与信号监测的同步进行。

二、反转录 - PCR（RT-PCR）

反转录 - PCR（简称 RT-PCR）及衍生的 RT-qPCR，是专为 RNA 分析设计的 PCR 变体，广泛用于临床与科研中的基因转录水平检测、病毒 RNA 定量等场景。

其核心是先通过 “逆转录（RT）” 过程，以单链 RNA 为模板合成互补 DNA（cDNA），这一步也被称为 “第一链 cDNA 合成”。具体过程为：

RNA 模板与 DNA 寡核苷酸引物结合，形成 DNA/RNA 杂交体；

逆转录酶（兼具 RNase 活性）催化反应，先降解杂交体中的 RNA 链，再通过自身的 DNA 聚合酶活性合成单链 cDNA。

需特别注意，高纯度、高质量的起始 RNA 是 RT-PCR 成功的关键前提。

根据操作流程，RT-PCR 可分为两种模式：

一步法 RT-PCR：逆转录与 PCR 反应在同一试管中完成，无需转移样品；

两步法 RT-PCR：逆转录与 PCR 反应分开进行，先合成 cDNA，再以 cDNA 为模板启动 PCR。

三、反转录 - 定量 PCR（RT-qPCR）

为实现 RNA 的精准定量，研究人员将 “逆转录” 与 “qPCR” 结合，开发出反转录 - 定量 PCR（RT-qPCR）技术。它本质是先通过逆转录将 RNA 转化为 cDNA，再以 cDNA 为模板进行 qPCR 扩增，最终通过荧光信号定量初始 RNA 的含量（包括基因转录本、病毒 RNA 基因组等）。

与 RT-PCR 类似，RT-qPCR 也分为两种操作模式：

一步法：逆转录与 qPCR 在同一反应管中连续进行，操作简便且能减少污染；

两步法：先单独完成逆转录获得 cDNA，再取部分 cDNA 进行 qPCR，灵活性更高，可对同一份 cDNA 进行多次扩增。

四、数字 PCR（dPCR）与数字滴定 PCR（ddPCR）

数字 PCR（dPCR）是对传统 PCR 方案的突破性改良，虽同样依赖 DNA 聚合酶与引物探针扩增目标序列，但核心差异体现在 “反应分区” 与 “数据采集方式” 上。

dPCR 的技术核心是 “限制性稀释”：将整个 PCR 反应体系分割成大量纳升体积的子反应单元（即 “分区”），每个分区内独立进行 PCR 扩增。反应结束后，通过泊松统计学分析每个分区 —— 含目标序列的分区会产生阳性信号，不含目标的则为阴性，最终通过阳性分区的比例计算原始样品中目标 DNA 的绝对拷贝数，无需依赖标准品。

数字滴定 PCR（ddPCR）是 2011 年起投入使用的新一代技术，它通过水油乳剂将反应体系拆分为大量微小液滴，这些液滴相当于独立的 “微型试管”，PCR 扩增就在液滴内进行，进一步提升了分区的均匀性与检测精度。

五、微流控 PCR

随着微流控技术的发展，带有微通道、微反应室的微型处理系统逐渐应用于 PCR 领域，形成 “微流控 PCR” 技术。

这类 PCR 的优势十分显著：

速度快：样品流经微流控芯片的微通道时，会反复经过对应 “变性、退火、延伸” 的三个温度区，大幅缩短反应时间 —— 例如 10μL 样品完成 20 个 PCR 循环仅需 90 秒；

成本低：试剂消耗量远低于传统 PCR；

灵敏度高：适配微量样品检测。

这些特点使其特别适合 “即时检测（POCT）” 场景，如现场病原诊断等。反应结束后，扩增产物可便捷地转移至芯片外进行后续分析。

不同类型的 PCR 技术各有优劣，适用的应用场景也存在差异（表 1 总结了各类技术的核心优势）。在实际实验中，需根据研究目标（如定性 / 定量、DNA/RNA、微量 / 大量样品）选择适配的技术方案。