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聚焦肿瘤 I EGFR卷了20年—四代TKI, 单/双抗,ADC三足鼎立

619 人阅读发布时间:2026-06-30 10:34

EGFR(表皮生长因子受体/HER1)是跨膜酪氨酸激酶受体,在正常细胞中调控增殖、分化;突变后持续激活,驱动肿瘤发生。

一、EGFR核心激活流程

1、配体结合:EGF/TGF-α等与EGFR胞外区结合。

2、受体二聚化:形成同源/异源二聚体(如EGFR-EGFR、EGFR-HER2)。

3、自磷酸化:胞内酪氨酸激酶域被激活,发生自磷酸化。

4、下游通路启动:

①RAS-RAF-MEK-ERK:促进肿瘤细胞增殖、侵袭;

②PI3K-AKT-mTOR:抑制细胞凋亡、促进存活与血管生成;

③JAK2-STAT3:介导免疫逃逸、炎症与肿瘤进展。

新闻图片1

图:EGFR信号通路(From LaBEx)

二、EGFR靶点主要药物形式

目前,市场主流研究的药物分子形式主要有:小分子:EGFR-TKI(酪氨酸激酶抑制剂),抗体类:EGFR单抗,EGFR/cMet双抗,EGFR ADC,当然也出现EGFR PROTAC一些新型药物分子形式。主要分子形式及必要检测实验如下:

药物类别

核心作用机制

体外必做核心实验模块

核心检测指标

小分子EGFR-TKI(酪氨酸激酶抑制剂)

结合 EGFR 胞内激酶结构域 ATP 结合口袋,直接抑制 EGFR 酪氨酸激酶催化活性,阻断受体自磷酸化及下游信号通路传导,抑制肿瘤细胞增殖

1. 分子激酶生化实验
2. 细胞通路抑制实验
3. 细胞增殖/凋亡功能实验
4. 体外ADME成药性实验
5. 耐药突变株药效验证

1. 激酶活性:WT/19del/L858R/T790M/C797S 等突变 EGFR 激酶 IC₅₀、激酶选择性谱
2. 通路指标:p-EGFR (Y1068/Y1173)、p-ERK1/2、p-AKT (S473)
3. 功能指标:细胞增殖 IC₅₀、克隆形成率、凋亡率、G0/G1周期阻滞比例
4. ADME 指标:Caco-2渗透性、肝微粒体代谢稳定性、CYP450酶抑制/诱导、血浆蛋白结合率

抗EGFR单抗/双抗药物

结合 EGFR 胞外配体结合区,竞争性阻断 EGF 等配体与 EGFR 结合,抑制受体二聚化与激活;同时可通过 ADCC/CDC 等免疫效应杀伤肿瘤细胞;双抗可同时结合 EGFR 与另一靶点(如 PD-L1、VEGFR2),实现协同抑制

1. 靶点结合与配体竞争实验
2. 细胞EGFR通路抑制与降解实验
3. 细胞增殖/凋亡功能实验
4. 免疫效应功能实验
5. 双抗专属双靶点结合/桥接实验

1. 结合指标:细胞膜EGFR结合阳性率、EGFR胞外区结合KD值、EGF配体竞争阻断率
2. 通路指标:p-EGFR (Y1068/Y1173)、总 EGFR、p-ERK1/2、p-AKT (S473)
3. 功能指标:细胞增殖 IC₅₀,克隆形成率、凋亡率、G0/G1周期阻滞比例
4. 免疫指标:ADCC靶细胞裂解率、CDC补体介导裂解率
5. 双抗指标:双靶点同时结合率、靶细胞桥接效率

抗 EGFR ADC 药物(抗体偶联药物)

由抗 EGFR 单抗、连接子、细胞毒性 payload 三部分组成;抗体结合 EGFR 后介导 ADC 内吞进入肿瘤细胞,连接子裂解释放 payload,杀伤肿瘤细胞;同时可通过旁观者效应杀伤周边肿瘤细胞

1. 靶点结合与内吞实验
2. 细胞增殖/凋亡杀伤实验
3. payload 释放与活性验证实验
4. 旁观者效应实验
5. 脱靶毒性评估实验

1. 结合与内吞指标:细胞膜 EGFR 结合阳性率、ADC 细胞内吞率、EGFR-ADC 共定位率
2. 杀伤指标:细胞增殖抑制 IC₅₀、凋亡率、细胞周期阻滞比例
3. payload 指标:细胞内payload释放量、游离 payload细胞毒活性
4. 旁观者效应:共培养体系中旁邻细胞杀伤率
5. 脱靶指标:EGFR 阴性细胞杀伤 IC₅₀、正常细胞毒性

 

三、AACR 2026 EGFR最受关注药物

1、最受瞩目:HS-10504(翰森制药,中国),定位:全球临床数据最硬的C797S四代TKI,AACR 2026 EGFR口头报告。C797S ORR 52.9%,全球最强。

2、第二热度:Amivantamab+拉泽替尼(强生Janssen/再鼎),定位:EGFR一线/二线双靶新标准,MARIPOSA长期随访更新,靶点:EGFR/c-Met 双抗+三代TKI。序贯获益实锤。

3、第三热度:HER3-DXd(U3-1402,第一三共/默沙东),定位:EGFR 耐药“ADC”,覆盖C797S/MET/20ins。所有耐药都有效。

4、第四热度:舒沃替尼(Sunvozertinib,迪哲医药),定位:EGFR 20ins一线口服新标准(ASCO LBA,AACR机制补充)。口服去化疗。

5、潜力新星:ABK-EGFR-1(和誉医药,中国),定位:临床前最优脑转移四代TKI。临床前最优脑穿透。

三、EGFR靶点相关研究(整理上述三个分子形式检测)

(一)EGFR激酶活性检测

UA-Glo® Kinase ADP Assay(Cat.UA070101)应用化学发光发光检测方法用于激酶活性检测是最普及方法之一。其原理是蛋白激酶在酶反应过程中会消耗ATP将下游底物磷酸化,并将ATP转换成ADP的过程,利用化学发光检测ADP的量,即可反应酶活情况。高灵敏度,适合多种激酶。适用于高通量筛选,可区分ATP竞争性和非竞争性抑制剂。

新闻图片2

图:UA-Glo®检测原理示意图

ATP竞争性化合物H8-9和ATP非竞争性化合物PKI是激酶PKA的抑制剂。两个化合物在三ATP浓度:10/100/500μM的条件下进行激酶反应之后用UA-Glo激酶ADP检测试剂检测产生的ADP。化合物在不同ATP浓度下的剂量-效果曲线和EC50结果见下图。ATP竞争性化合物H8-9的EC50随反应中ATP浓度增加而增大,而ATP非竞争性化合物PKI的EC50基本不受ATP浓度的影响。使用市场品牌PC对H8-9在同样实验条件,ATP浓度10μM和100μM时测得EC50分别为65nM和567nM, 和UA-Glo激酶ADP检测试剂测得EC值一致。

新闻图片3

图:检测化合物H-89 和PKI的EC50

(二)信号通路抑制-磷酸化EGFR检测

THUNDER TR-FRET时间分辨荧光共振能量转移,检测技术灵敏度高,特异性好,重复性好,操作简单,仅需1h。一种基于荧光共振能量转移(FRET,Fluorescence Resonance Energy Transfer)和时间分辨荧光(TRF, Time-Resolved Fluorescence)的技术,采用夹心法,检测胞内EGFR磷酸化水平和总EGFR水平。

THUNDER™Phospho-EGFR (Y1068) TR-FRET Cell Signaling Assay Kit(Cat.No.KIT-EGFRP-500)

新闻图片4

图:THUNDER Phospho-EGFR(Y1068)检测原理及流程

A431细胞(每孔40,000个细胞;三复孔),用梯度稀释的EGF在室温(RT)下孵育10分钟。数据显示,用EGF处理A431细胞可刺激EGFR在Y1068位点发生磷酸化。将A431细胞(每孔40,000个细胞,三复孔)与梯度稀释的西妥昔单抗室温孵育30分钟;随后加入 50nM表皮生长因子(EGF),室温刺激细胞10分钟。实验数据表明:西妥昔单抗处理A431 细胞,可抑制EGF诱导的表皮生长因子受体(EGFR)Y1068位点磷酸化。

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图:THUNDER Phospho-EGFR(Y1068)检测数据

(三)抗体(ADC)内化功能检测

基于pH探针的内化检测:pH-sensitive IgG labeling reagents Max(Green) (Cat.No.UA070122)利用pH敏感的荧光探针标记抗体,当抗体被细胞内吞并进入酸性的内体或溶酶体时,荧光信号增强,从而可以评估内化效率。

这是一种新型荧光染料,当其周围环境pH值酸性增强时,它会显著增强荧光亮度。pH-sensitive lgG labeling reagents染料偶联物在细胞外不发出荧光,但在内化后在酸性pH环境下细胞中会发出明亮的绿色荧光。在中性和碱性pH值时,pH-sensitive lgG labeling染料发射荧光信号强度最低;随着酸化,pH-sensitive lgG labeling染料的发射荧光信号强度增加多达8倍(pH值为4时)。

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图:PH敏感型染料工作原理

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图:PH敏感型染料操作流程及测数据

(四)细胞功能实验

1、细胞活力/增殖检测

UA-Glo®Luminescent Cell Viability (Cat. No.UA070103)基于ATP依赖的荧光素酶(Luciferase)催化反应。荧光素酶在Mg2+存在下,以荧光素、ATP和O₂为底物,将化学能转化为光能。由于ATP是活细胞能量代谢的核心分子,其含量与活细胞数量呈线性正相关,因此发光强度可直接反映细胞活力。肿瘤细胞的活力检测,要考虑其成球的特性,建议使用裂解效果后更好的UA-Glo® 3D Luminescent Cell Viability(Cat. No.UA079011)。当然,传统的CCK8(Cat. No.abs50003)检测也是非常经典的方法。

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图:UA-Glo® Luminescent Cell Viability检测原理

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图:检测化合物Staurosporine在不同肿瘤细胞中的活性

2、ADCC效应

Reporter gene实验,报告基因检测方法在抗体药物研究中极为常用,适用于如:细胞表面的阻断效果检测,ADCC,CDC及ADCP等实验中。同样利用荧光素酶检测原理,将酶构建到细胞系中,检测只需加入底物即可得到结果。方便,快捷,通用性强。在做细胞毒性检测和ADCC效应时,LDH法(Cat.No.abs580236)仍然使用频率率高的一项技术。

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图:Luciferase Assay原理示意图

不同Luciferase Assay在不同应用场景的优势,体现该技术应用范围极为广泛。

 

新闻图片11

图:Luciferase Assay应用场景及特点展示

UA-Glo® Bio-luc Luciferase Assay(Cat.UA079032)荧光素酶报告基因检测更适用于ADCC等杀伤实验。HEK293细胞接种于6孔培养板,细胞密度为80-90%。转染表达萤火虫荧光素酶报告基因的质粒,转染后48hr将细胞重悬于DMEM(10%FBS)培养基,加细胞到96孔白框透明细胞板中, 50,000/5,000 细胞/孔,每孔50μL。加入平衡至室温的Bio-Luc荧光素酶报告基因检测试剂后在10min进行检测,结果如图。PC为进口品牌试剂。

新闻图片12

图:Bio-Luc检测数据与竞品对比数据

(五)细胞因子释放检测

EGFR靶点研究中,细胞因子释放检测不作为重点检测指标,但常作为辅助ADCC/CDC效果的检测指标,又或者,在研究比如EGFR×CD3/PD-L1此类双抗,需要检测T细胞活化,需要检测细胞因子释放。

THUNDER TR-FRET Human IFNγ

THUNDER细胞因子检测是基于双抗体夹心法,标记荧光供体和受体的Human IFNγ 抗体Eu-Ab1和FR-Ab2,分别与样品中IFNγ结合,产生能量共振转移FRET(615nm),进而产生665nm荧光信号,荧光信号强度与IFNγ浓度成正比。全程仅需2h,免洗,可高通量。检测灵敏度高,上限宽。

THUNDER TR-FRET Human IFNγ(Cat.No.KIT-IFNG-500) 检测范围:21–30,000 pg/mL

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图:Human IFNγ 检测原理,流程及标准曲线

HICA Human IFNγ

HICA Human IL2(Cat. No.UA086035)采用双抗体夹心的均相化学发光法进行细胞因子浓度的检测,操作简单,无需洗涤。检测体系中包含两种微球:受体微球偶联Anti-IL2的抗体1,供体微球偶联链霉亲和素,同时使用生物素标记的Anti-IL2抗体2。反应时,两种微球相互靠近间距小于200 nm时,受光(680nm)激发后产生的单线态氧可转移至受体微球并引发化学发光(615nm)通过检测化学发光信号强度与IL2浓度成正比关系。该方法具有操作简便、反应快速、超高灵敏度,免洗,可适用于血清等复杂样本。

HICA Human IL2检测范围:0-100,000pg/mL。

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图:HICA Human IL2检测原理及检测数据

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