IHC免疫组化常见问题回复

（1）膜上？或切片上有剩余的位点可以非特异性吸附抗体，造成后续结果的假阳性！
（2）封闭血清一般是和二抗同一来源的，血清中动物自身的抗体，预先能和组织中有交叉反应的位点发生结合，否则在后面的步骤中如果和二抗发生结合，会造成背景。
（3）也可以用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能与一抗来源一致。

DAB显色时间如何把握？ 
 
（1）DAB显色时间不是固定的，主要由显微镜下控制显色时间，到出现浅棕色本底时即可冲洗；
（2）DAB显色时间很短（如几秒或几十秒）就出现很深的棕褐色，这很可能说明你的抗体浓度过高或抗体孵育时间过长，需要下调抗体浓度或缩短你的抗体孵育时间；
（3）此外，若很短时间就出现背景很深，还有可能你前面的封闭非特异性蛋白不全，需要延长封闭时间；
（4）DAB显色时间很长（如超过十几分钟）才出现阳性染色，一方面可能说明你的抗体浓度过低或孵育时间过短（最好一抗4度过夜）；另一方面就是封闭时间过长。

DAB显色后发现切片着色不均匀：如一片着色，一片不着色或染色浅？
着色不均匀可能与你的实验手法有很大关系，可能原因有：
（1）切出的片子厚度本身可能就不一样，切出一片厚，一片薄，这样可能造成着色深浅不一。
（2）有可能是你的显色液底物加到片子上后没有摇匀，造成局部底物浓度不一致，所以加完显色液后最好将片子来回左右晃动几下，使片子上所有区域的底物浓度一致。
（3）如果你的片子是中间的染色深，靠近边上的浅，那有可能是你蜡圈画的太小，显色液覆盖的面积不过大而产生了边缘效应。最外侧的组织片最好离显色液外缘0.5cm。

 在什么情况下使用Triton-X100
 1）Triton X-100化学名称为聚乙二醇辛基苯基醚，是一种去污剂。在免疫组织化学（>10um厚切片） 和免疫细胞化学中一般用Triton X-100 作为细胞通透剂，在膜上打孔。

在什么情况下进行组织抗原修复，抗原修复的条件是什么？

（1）由于组织中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定过程中，发生了蛋白之间交联及醛基的封闭作用，从而失去抗原性。通过抗原修复，使得细胞内抗原决定族重新暴露，提高抗原检测率。
（2）修复方法从强到弱一般分为三种，高压修复、微波修复、胰酶修复。修复液也分为若干种（具体的可以查阅相关资料，大量的：中性的、高pH的等）。
 （3）微波修复，我们一般用6min*4次，效果不错。
脱片产生的原因有哪些？

（1）多聚赖氨酸玻片质量的问题。
（2）组织切的不好，切片机的问题例如比较老的旧的机器切的厚或者不均匀，或者切片者手法不好等。
（3）没烤好，时间短，温度不够之类。
（4）操作的时候甩的太猛了，有脱片嫌疑的片子最好不甩或轻轻甩，用卫生纸从边缘上慢慢吸水。
（5）修复的问题：抗原修复的时候高压时间过长了，或者放进100度的修复液时手法不好，咚的一声就丢进去了，这样超容易脱片。此外，用EDTA修复比柠檬酸容易脱片，但是你要用到EDTA的时候也没办法，只有从另外的问题上着手。
（6）一旦见到有组织漂起来操作就更加要谨慎，用PBS的时候尽量用泡的，不要冲。基本上把这些方面都注意到了，能改善的尽量改善，脱片可以减少很多。
（7）组织的问题，越是癌症组织有坏死之类越容易脱。

切片染色后背景太深，如何区分特异性与非特异性着色？

全片着色是指整个切片全都染上了颜色，着色的强度可深可浅，总之，分不清那些组织是阳性那些组织是阴性。出现这种现象的原因有：

（1）抗体浓度过高：一抗浓度过高是常见的原因之一。解决办法是，每次使用新抗体前应当对其工作浓度进行测试，使每一抗体个体化，找到适合自己实验室的理想工作浓度，既使是即用型的抗体也应如此，不能只简单的按说明书进行染色。

（2）抗体孵育时间过长或温度较高：解决办法是，严格执行操作规程，最好随身佩带报时表或报时钟，及时提醒，避免因遗忘而造成时间延长。现在流行的二步法（Polymer）敏感性很高，要求一抗孵育的时间不是传统的1小时，而是30分钟，因此，要根据染色结果进行调整。

（3）DAB变质和显色时间太长：DAB最好现用现配，如有沉渣应进行过滤后再用。配制好的DAB不应存放时间太长，因为在没有酶的情况下，过氧化氢也会 游离出氧原子与DAB产生反应而降低DAB的效力，未用完的DAB存放在冰箱里几天后再用这种似乎节约的办法是不可取的。DAB的显色最好在显微镜下监 控，达到理想的染色程度时立即终止反应。不过当染色片太多时或用染色机时，这样做似乎不现实，但至少应对一些新的或少用的抗体显色时进行监控，避免显色时间过长。

（4）组织变干：修复液溢出后未及时补充液体、染色切片太多、动作太慢、忘记滴液、滴液流失等都是造成组织变干的原因。解决的办法是操作要认真仔细，采用DAKO笔或PAP Pen在组织周围画圈，可以有效的避免液体流失，也能提高操作速度。

（5）切片在缓冲液或修复液中浸泡时间太长（大于24小时）：原因上不清楚，但现象存在。有的实验室喜欢前一天将切片脱蜡至修复，第二天加抗体进行免疫组 化染色，如果将装有切片和修复液的容器放在4oC冰箱过夜，对结果无明显影响，如果放在室温，特别是炎热的夏天，会出现背景着色，因此，不可存放时间太 长。

（6）一抗变质、质量差的多克隆抗体：注意抗体的有效期，过期的抗体要麽不显色要麽背景着色。用新买的抗体时最好设立阳性对照和用使用过的抗体作比较。