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5803 人阅读发布时间:2020-12-17 09:54
层析柱的柱效测定是在纯化实验中非常重要的步骤,也是我们得到准确结果的保证。如果您是自己装柱,建议您在使用前先做柱效测定来确定柱子的效果。另外,当层析柱使用过一定次数,或者发生实验结果异常,柱子进入气泡,超压等问题,我们也可以对柱子进行柱效测定来判断柱效是否正常。
一、柱效测定标准
Pulse test是目前最常用的测试方法,即使用少量的样品流经装填好的层析柱中,通过仪器上的检测器检测实验过程,实验结束后对洗脱峰进行分析。
柱效测定主要通过计算理论踏板高度(HETP)和对称性(As)来确定。
01
理论踏板高度
1952年,马丁(Martin)和欣革(Synge)最早提出踏板理论(Plate theory),把一根连续的层析柱设想成由许多小段组成,在每一小段内,假定样本可以在固定相和流动相中达到分配平衡,这样一个小段称为理论踏板,一个理论踏板的长度称为理论踏板高度。主要反映柱子的分离效果。
HETP判断标准:

HETP=L/N
HETP:理论踏板高度
L:柱床高度
N=5.54 x (Ve/W1/2)2
Ve:峰洗脱体积
W1/2:50%峰高位置的峰宽
一般来说,当HETP/填料粒径(dp)<=3时,认为柱效较高。
02
对称性
10%峰高处的前后半峰宽的比值,主要反映峰的对称性。
As判定标准:

As:峰对称性
As=b/a
b:10%峰高位置的后一半峰宽
a:10%峰高位置的前一半峰宽
一般来说,0.8 < As < 1.8时认为柱子装填效果比较好。
二、柱效测定方法

三、Unicorn软件操作
柱效测定可以通过Unicorn软件操作和自动计算。
在 Unicorn 软件中的「method editor」模块中,内置了柱效测定方法模板,即「column performance test」的程序模板,方法包含「equilibration」和「column performance test」两个阶段,利用简单填空的方式,将流速、上样体积等条件添加进去,就可以自动运行一个柱效测定的程序啦!

柱效测定实验完成后,我们需要利用 HETP 和 As 两个参数定量描述我们的装柱效果,在「Evaluation」模块中打开运行之后的结果,点击上方工具栏「Peak Integrate」图标,如下方红色方框所示,可以对峰进行积分。在积分表格旁的空白处,右击鼠标,选择「customize」选项,勾选「HETP」和「As」,结果就会出现在积分表格中。
