两篇文献带你了解膜蛋白纯化策略

膜蛋白在细胞中扮演着重要的角色，他们参与细胞与细胞之间、细胞与细胞基质之间的相互联系及细胞的形成过程，各种离子、代谢产物和蛋白质的跨膜运输。鉴于膜蛋白在多种细胞功能中的重要性，越来越多的膜蛋白成为各种疾病的药物靶点，膜蛋白的研究也逐渐成为近年来研究热点。

纯化出高纯度的蛋白是研究膜蛋白结构、功能等的前提，因此膜蛋白的纯化策略也是大家越来越关注的话题。

今天小编就带大家来看一下膜蛋白纯化吧！

膜蛋白的表达系统：原核表达（大肠杆菌、芽孢杆菌）、哺乳细胞（HEK293）、酵母表达、昆虫细胞表达。

不同的表达系统的优缺点

操作要点：

1、细胞破碎方法：离心和渗透压结合的方法、超声破碎法、机械、均质化

2、膜结构组份一般需要4℃，超速离心，收集

3、去垢剂增溶：去垢剂是同时具有亲水性和疏水性基团的双极性分子，能够使磷脂双分子层解体并释放膜蛋白，并且为去膜状态下的膜蛋白提供稳定的疏水环境。去垢剂也需要筛选合适的种类和浓度。

4、对于外源表达的膜蛋白，一般用亲和+分子筛的层析方法分离纯化蛋白。

下面以两篇文章解析膜蛋白的纯化方法

纯化思路：

（1）重组蛋白的构建：

以pRSET B vector为载体，以Escherichia coli 21（DE3）为表达宿主，在碳末端依次加了GFP和His标签。

（2）重组蛋白的诱导表达：

     37℃条件下，诱导表达12-15 h。

（3）收集、破碎菌体：

在15,600g 离心5 min收集菌体。超声破碎缓冲液为50 mM PBS pH 7.3含有0.3 M NaCl, 加入蛋白酶抑制剂混合物进行超声破碎。

（4）超速离心收集膜组份：

在100,000g离心力下4℃离心1h，留沉淀，用缓冲液洗一次，再离心收集沉淀。

（5）去垢剂增溶：

本文作者着重对膜组份增溶中，对去垢剂的种类和浓度进行优化，基本缓冲液为50 mM PBS pH 7.3含有0.3 M NaCl，再加入相对应浓度的增溶剂，4℃溶解45 min后，100,000g离心1 h，留上清，做SDS-PAGE以及在490nm下测GFP吸光度值，发现β-DDM和β-DM的溶解效果比较好。

图1 不同浓度、种类的增溶剂提取的膜蛋白的SDS-PAGE图和GFP吸光度值

（6）CapA重组蛋白的纯化：

①亲和层析：

纯化条件：

Binding buffer: 50 mM PBS pH 7.3, 0.3 M NaCl 20 mM imidazole

Wash buffer: 50 mM PBS pH 7.3, 0.3 M NaCl 50 mM imidazole

Elution buffer：50 mM PBS pH 7.3, 0.3 M NaCl 500 mM imidazole

图2 Histrap纯化后不同浓度梯度的SDS-PAGE图

②凝胶过滤层析：

用 Superdex 200 Increase预装柱， 20 mM HEPES，pH 7.0，以及0.3 M的氯化钠和去垢剂。

图3 凝胶过滤层析图

结果发现不同的去垢剂组份纯化出的蛋白的聚合体不一样。

纯化思路：

（1）重组蛋白的构建：

以哺乳细胞HEK293F为表达宿主，目的基因为在碳末端依次加了Strep和His标签。

目的基因：TCRα，TCRβ（pCAG）+CD3γ、δ、ε、ζ（pcDNA3,4）。

（2）重组蛋白的诱导表达：

在37℃、含有5%CO2条件下，120 rpm 培养60 h。

（3）细胞膜结构的制备和溶解：

通过离心收集细胞，然后匀浆破碎。

细胞膜结构组份的收集：用25 mM HEPES，pH 7.5,1 M NaCl缓冲溶液重悬，加入1mM PMSF，100,000g超速离心30 min收集细胞膜结构组份。

细胞膜结构的溶解：用25 mM HEPES，pH 7.5,150 mMNaCl，1% DDM，0.2% cholesteryl hemisuccinate tris salt, 1 mM PMSF, 4℃条件下溶解2 h。

40,000g 离心30 min，收集上清，即为可溶的膜蛋白粗溶液。

（4）亲和层析纯化：

本文作者用StrepTactin 填料进行纯化。

结合条件：4℃结合3 h；

Wash buffer: 25 mM HEPES，pH 7.5, 300 mM NaCl, 0.06% digitonin;

Elution buffer: 25 mM HEPES, pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.06% digitonin+4 mM desthiobiotin

图1 亲和层析后，各个亚基的SDS-PAGE图

（5）膜蛋白复合体交联

蛋白质浓缩后用0.1%(v/v)的戊二醛交联40min，得到膜蛋白复合体。

（6）凝胶过滤分子筛层析：

用Superose 6 increase 10/300, buffer为25 mM HEPES, pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.06% digitonin。

图2 TCR-CD3复合体SDS-PAGE图

膜蛋白复合体TCR-CD3交联后进行凝胶过滤分子筛层析，进行SDS-PAGE实验，发现得到比较纯的复合体。

 （7）TCR-CD3结构分析

通过冷冻电镜分析，TCR-CD3 TCR–CD3复合物的最终原子模型包含全长TCRαβ的亚基，完整的ECD和跨膜螺旋CD3γε，CD3δε和CD3ζζ。

图3 TCR–CD3复合体结构图

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