两篇文章带你深入了解铁死亡！（上）

铁死亡(Ferroptosis)是一种铁离子依赖性的，区别于细胞凋亡、细胞坏死、细胞自噬的新型程序性细胞死亡形式。既然是一种程序性细胞死亡，这意味着它可以被调控。

从发生机制上讲铁死亡主要是在二价铁离子或酯氧合酶的作用下，催化细胞膜上高表达的不饱和脂肪酸，发生脂质体过氧化，从而诱导细胞死亡，还表现在抗氧化体系谷胱甘肽GSH和谷胱甘肽过氧化物酶4-GPX4的表达量降低。

铁死亡主要有以下几个特点：

(1)细胞形态方面：铁死亡会导致细胞线粒体变小，膜密度增高，嵴减少、消失，外膜破碎。细胞核中形态变化不明显。

(2)细胞成分方面：铁死亡表现为脂质过氧化增高，ROS升高。也有一些特征基因发生变化。

铁死亡通路图

从过去几年国家自然科学基金中标的项目我们发现，从2013年申请第一项关于“铁死亡”的项目，2017年增加到16项，到2019年增至76项，累计资助经费6008.2万，都说明了铁死亡研究不断受到科学家的重视，成为细胞死亡研究新的“宠儿”。

“铁死亡”入选中国科学院2019生物科学领域TOP 10（图2）

图2：《2019研究前沿》生物科学领域TOP 10

第一篇是关于p53能够通过SLC7A11调节胱氨酸代谢，调控ROS应答并通过铁死亡抑制肿瘤生长，第二篇则是今年发表在nature research上的关于能量胁迫可以激活AMPK激活，从而抑制ACC并降低花生四烯酸这个多聚不饱和脂肪酸的合成，最终抑制铁死亡。

Ferroptosis as a p53-mediated 

activity during tumour suppression

早在2015年细胞生物学领域著名华人科学家顾伟教授在nature在线发表了一篇关于经典肿瘤抑制因子p53介导铁死亡过程，抑制肿瘤生长的文章。接下来跟大家一起看看这篇文章研究思路吧。

p53是一个经典的肿瘤抑制基因，在所有恶性肿瘤中，50%以上会出现该基因的突变。p53介导的细胞周期停滞、衰老和凋亡对抑制肿瘤的发展具有重要作用，同时研究也表明p53对细胞代谢活性的调节在其发挥抗肿瘤作用中也十分重要。

图一、SLC7A11基因是p53的靶点

a、在经过doxycycline 诱导的细胞中，WB和RT-PCR结果显示p53的激活会伴随着SLC7A11水平的降低；

b、SLC7A11的基因序列也显示其上存在p53的结合位点；

c、EMSA实验也显示，重组全长人类野生型p53与含有该位点的放射性标记寡核苷酸探针孵育后，可以鉴定出p53–DNA复合物；

d、ChIP 实验也验证了p53和SLC7A11的DNA序列存在相互作用；

e、用nutlin-3处理细胞，使p53激活/干扰掉p53时，SLC7A11的蛋白质水平伴随着显着降低/升高。这组实验充分说明了SLC7A11基因是p53介导的转录抑制的靶点。

既然SLC7A11是P53的靶点，那p533KR作为p53蛋白的一种乙酰化缺陷突变形式，但是它对SLC7A11的表达有作用吗？

接下来的一组实验则说明了p533KR虽然不能够诱导细胞周期暂停，衰老和凋亡过程，但完全保留了对SLC7A11表达的调控能力，并能够促使细胞在ROS诱导的应激状态下发生"铁死亡"过程。

图二、p533KR可以调节SLC7A11基因的表达和细胞对半胱氨酸的摄取

a、在细胞中用四环素诱导p533KR的表达，发现p533KR能够激活TIGAR和MDM2的表达，但不能激活p21或PUMA的表达，但是在p533KR诱导后的不同时间点，SLC7A11的水平都大大降低了；

b、ChIP 实验也验证了p533KR可以和SLC7A11的DNA序列可以相互作用；

c、在源自p53+/+、p533KR/3KR和p53-/-小鼠的MEF中，相对于野生型MEF，SLC7A11在p53–/–的细胞中表达明显增加，然而在p533KR/3KR细胞中的SLC7A11转录水平仍然很低，这表明p533KR可以抑制SLC7A11的表达；

d、在四环素诱导的p533KR细胞中发现细胞对胱氨酸摄取能力下降；

e、在源自p53+/+、p533KR/3KR和p53-/-小鼠的MEF中，p53-/-实验组对胱氨酸的摄取增加到比p53+/+组高出约60％的水平，这证明p53的缺失促进了细胞对胱氨酸的摄取，但是在p533KR/3KR实验组中细胞对胱氨酸的摄取没有变化，这表明p533KR/3KR保留了抑制细胞摄取胱氨酸的能力。

这组实验说明了p533KR可以调节SLC7A11基因的表达。

SLC7A11是质膜转运蛋白的关键成分，它可以介导细胞Na+依赖性的对胞外胱氨酸的摄取，以换取胞内谷氨酸。为了探索p53对SLC7A11抑制的功能，研究进一步分析了p53的激活对细胞摄取L--胱氨酸的影响。

研究表明，SLC7A11的表达对于铁死亡也很关键，在特死亡发生的过程中涉及到代谢功能的异常。p53既然能够调控SLC7A11的表达，也能影响细胞对胱氨酸的摄取，那p53是否能够铁死亡呢？接下来进行了如下实验。

图三、p53对铁死亡的调控作用

a、用铁死亡诱导剂erastin 处理小鼠的MEF细胞8h，发现p53+/+、p533KR/3KR组的中细胞死亡率超过48%，但在p53-/-实验组中细胞死亡率保持在20%的低水平。这说明p53的缺失可以避免erastin诱导的铁死亡；

b、通过代谢动力学分析，在6小时后在p53+/+、p533KR/3KR组的MEF细胞中可以很容易就检测到细胞死亡；

c、在经过erastin处理的细胞中，我们观察到线粒体收缩，膜密度增加，但没有明显的DNA断裂；

d、用铁死亡特异性抑制剂ferrostatin-1处理细胞，结果发现ferr-1可以抑制p53+/+和p533KR/3KR组的ME细胞死亡，但是其他细胞死亡抑制剂，如自噬（3-甲基精胺），细胞凋亡（Z-VAD-FMK）和坏死病（necrostatin-1）的抑制剂，均不能抑制erastin诱导的细胞死亡。这组实验说明了p533KR可以调节细胞对胱氨酸的摄取和促进铁死亡。

有研究表明，SLC7A11在多种形式的人类癌症中均过表达，p53可以调节SLC7A11基因的表达，那p53可以通过SLC7A11来抑制肿瘤生长吗？

图四、SLC7A11的表达对抑制p533KR诱导的肿瘤生长的作用

a、HE染色表明，SLC7A11在成对的结肠癌的邻近正常组织上没有检测到，但成对的结肠癌的质膜上检测到明显的SLC7A11；

b-c、在用erastin诱导SLC7A11的质粒转染的p533KR H1299 细胞中发现，SLC7A11过表达可以减轻p533KR依赖的铁死亡；

d-e、异种移植肿瘤生长试验也表明，p53缺失的肿瘤组织生长显着降低，但是在SLC7A11过表达的情况下，的抑制作用被很大程度上被减弱。这些数据表明SLC7A11的表达对抑制p533KR诱导的肿瘤生长至关重要。

多项研究表明，p53在细胞凋亡，细胞生长停滞和衰老中的典型活性是导致p53+/+Mdm2-/-小鼠胚胎致死性的主要原因。为了进一步探究进行了如下实验。

图五、p53介导的代谢调节胚胎发育的影响

a、检查了从p533KR/3KRMdm2+/-小鼠获得的胚胎，发现p53染色显着升高，但发育结构基本正常，这表明p533KR突变能够促进胚胎发育；

b、同时检测了p533KR/3KRMdm2+/-及其他实验组小鼠胚胎中Slc7a11  mRNA的量，发现p533KR/3KRMdm2-/-组的Slc7a11  mRNA明显下调；

c、经过ferr-1处理的p533KR/3KRMdm2-/-组胚胎在E14.5天（II）表现出明显的器官发生，例如眼部形成和四肢分化。而此时未经处理的p533KR/3KRMdm2-/-组胚胎却未成形，再重新经过ferr-1处理后胚胎也在长大，眼睛的结构得到了明显改善；

d、Ptgs2在p533KR/3KRMdm2-/-组胚胎中显着上调，但在p53-/-Mdm2-/-组胚胎不受影响，这表明p533KR/3KRMdm2-/-胚胎中Ptgs2的上调是p53依赖性的。

这组数据表明，p53介导的对代谢调节和铁死亡的影响对p533KR/3KRMdm2-/-胚胎发育至关重要。

通过对突变小鼠进行分析，研究人员发现这些p53的非经典活性能够促进胚胎发育以及与MDM2缺失相关的致死。同时，研究人员还发现SLC7A11在人类肿瘤中高表达。

为了在更佳的代谢条件下研究铁死亡，文章进一步分析了p533KR介导的铁死亡是否与ROS应激反应有关。最终发现，其过表达能够抑制ROS诱导的"铁死亡"并减弱p53 3KR介导的对肿瘤生长的抑制作用。

图六、p53介导的铁死亡对ROS应答的作用

a、仅分别通过p533KR诱导或ROS处理均未观察到明显的细胞死亡，但是同时经过p533KR诱导和ROS处理可诱导大量细胞死亡，而这种死亡可被ferr-1特异性抑制；

b、过表达SLC7A11也可以抑制经过p533KR诱导和ROS处理诱导的细胞死亡；

c、Nutlin-3对U2OS细胞进行处理，诱导了高水平的p53表达，而没有引起细胞死亡，而仅用ROS的处理组则没有诱导p53激活，也未能引起细胞死亡，但是在Nutlin-3和ROS共处理组出现了大量得到细胞死亡；

d、WB结果显示，相对于对照MEF组，Slc7a11-BAC组中的SLC7A11蛋白水平明显升高；

e、在野生型MEF中，用ROS或erastin处理均增强了铁死亡，但在Slc7a11-BAC组中铁死亡大大减弱。

这些数据表明，ROS特异性诱导了p53介导的铁死亡，而SLC7A11的水平对这一过程至关重要。

这项研究表明p53能够通过调节胱氨酸代谢，ROS应答和"铁死亡"抑制肿瘤生长的新模式，进一步拓展了人们对经典抗肿瘤因子p53的新认识，具有重要意义。

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