文献解析|揭示GAPDH的5-HT修饰：CD8+ T细胞代谢与抗肿瘤免疫的协同作用

GAPDH

文章摘要重述

本研究揭示了5-羟色胺（5-HT）的一种新型作用机制，即5-HT修饰。不同于传统的5-HT受体信号传导，本研究发现甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）能够发生5-HT修饰。这种修饰促进了GAPDH的细胞质定位，进而诱导CD8+ T细胞发生糖酵解代谢转变，显著提升了其抗肿瘤免疫活性。组织转谷氨酰胺酶2（TGM2）负责将5-HT连接到GAPDH的第262位谷氨酰胺上。同时，CD8+ T细胞通过促进色氨酸羟化酶1（TPH1）的合成及血清素转运体（SERT）的功能，增加细胞内5-HT水平，进一步促进5-HT修饰。值得注意的是，单胺氧化酶A（MAOA）作为降解5-HT的酶，对CD8+ T细胞具有负调控作用。此外，过表达能产生5-HT的TPH1嵌合抗原受体T（CAR-T）细胞，可诱导强烈的抗肿瘤反应。本研究不仅扩展了神经免疫相互作用的认知范围，还为5-HT的翻译后修饰提供了新的证据，揭示了其不依赖于受体的新功能。

研究背景重述

5-羟色胺（5-HT），一种关键的神经递质，主要由色氨酸在色氨酸羟化酶（TPH）的作用下代谢产生。在中枢神经系统中，5-HT对愉悦情绪的产生、睡眠周期的调节以及记忆增强等生物学行为起着重要作用。值得注意的是，人体中超过90%的5-HT分布于外周系统。近年来，外周5-HT在感染、凝血、自身免疫性疾病、肝脏再生以及肿瘤等多种生理病理过程中的重要作用逐渐得到证实。传统的细胞生物学理论认为，5-HT主要通过激活靶细胞膜上的受体来发挥其生物学功能。然而，最新的研究发现，5-HT还可以被修饰到蛋白质的谷氨酰胺残基上，导致蛋白质发生5-HT化翻译后修饰，从而调节其功能。这一新发现为理解5-HT的生物学作用提供了全新的视角。

研究结果重述

一、5-HT对CD8+T细胞的激活作用及诱导GAPDH的5-HT化修饰

近期的研究揭示了5-HT在神经免疫信号传递中的关键作用。为了深入探究5-HT在抗肿瘤免疫中的具体作用，本研究首先聚焦于外周5-HT对免疫细胞发育的潜在影响。实验结果显示，5-HT能够直接促进在aCD3/aCD28刺激下的CD8+ T细胞增殖，并增加IFN-γ的产生，同时上调了与CD8+ T细胞活化相关的基因表达（见图1A-C）。

为了进一步识别可能发生5-HT化修饰的蛋白，我们使用了丙炔化5-HT类似物5-PT来刺激CD8+T细胞，并通过Click Chemistry结合Streptavidin-Biotin系统成功捕获了与5-PT结合的蛋白。随后的蛋白质谱分析（见图1D-E）不仅确认了已知可发生5-HT化修饰的蛋白，如actin和H3，还发现了多个与糖酵解途径密切相关的蛋白，其中GAPDH的排名最为靠前（见图1F-G）。鉴于糖酵解代谢是激活杀伤性CD8+ T细胞的重要标志，我们对质谱分析中排名前三的糖酵解相关蛋白（GAPDH、ENO1、LDHA）进行了活性检测。结果显示，仅有GAPDH的蛋白活性在5-HT刺激后显著升高（见图1H）。此外，通过Western Blotting（WB）实验，我们进一步证实了GAPDH能够发生5-HT化修饰。这些发现提示我们，GAPDH的5-HT化可能增强了其糖酵解活性，从而在CD8+ T细胞的激活过程中发挥了重要作用。

二、GAPDH的5-HT化修饰对糖酵解代谢及CD8+ T细胞抗肿瘤免疫活性的促进作用

组织转谷氨酰胺酶（TGM）家族作为介导5-HT化修饰的核心酶类，包含TGM1至TGM7共七个亚型。通过RNA测序及PCR验证，本研究发现CD8+ T细胞主要表达TGM2亚型（见图2A-B）。为了深入探究TGM2在5-HT化修饰及CD8+ T细胞功能中的作用，我们构建了CD8+ T细胞TGM2基因条件性敲除（Tgm2fl/flCD8-Cre）小鼠模型（见图2C）。

体外实验结果显示，在TGM2敲除的CD8+ T细胞中，5-HT无法有效促进其增殖、IFN-γ的产生以及糖酵解代谢（见图2E-F）。进一步地，体内实验也证实，在Tgm2fl/flCD8-Cre小鼠中，Panc02胰腺癌细胞和MC38结肠癌细胞的生长速度明显加快，同时伴随着CD8+ T细胞的浸润减少以及IFN-γ含量的降低（见图2H-K）。这些结果强烈表明，GAPDH的5-HT化修饰对于促进CD8+ T细胞的糖酵解代谢及增强其抗肿瘤免疫活性具有至关重要的作用。

三、CD8+ T细胞中GAPDH的Gln262位5-HT化修饰促进其胞质定位及糖酵解活性

质谱分析揭示，GAPDH的第46、76、183、202和262位谷氨酰胺（Gln）均可发生5-HT化修饰（见图3A）。然而，进一步的研究发现，仅Q262A位点的突变与GAPDH的糖酵解活性紧密相关（见图3D）。为了特异性地检测GAPDH Q262位的5-HT化修饰，我们制备了针对性的抗体，并通过Western Blotting（WB）、共聚焦显微镜以及流式细胞术，在CD8+ T细胞中验证了GAPDH Q262ser的表达（见图3E-G）。

值得注意的是，GAPDH的262位氨基酸位于其核定位序列（NES）中。通过共聚焦显微镜观察，我们发现GAPDH在静息状态下的CD8+ T细胞中主要分布于细胞核内；然而，在CD8+ T细胞被激活后，GAPDH的胞质分布显著增加，并且这一过程可以被5-HT进一步促进（见图3H-I）。为了验证质谱分析的结果，我们发现仅Q262A突变能够抑制GAPDH的活性，并且该突变体无法响应5-HT诱导的GAPDH活性增强（见图3J）。此外，GAPDH-Q262A突变体也无法响应激活的CD8+ T细胞以及5-HT诱导的GAPDH胞质异位和糖酵解代谢的增强（见图3K-M）。这些结果有力地支持了我们的假设，即CD8+ T细胞中GAPDH的Gln262位5-HT化修饰对其胞质定位及糖酵解活性的提升具有关键作用。

四、细胞内5-HT积累对增强CD8+T细胞活性及抗肿瘤免疫的重要性

通过RNA-seq和qPCR分析，我们发现正常CD8+ T细胞几乎不表达5-HT合成酶Tph1或Tph2，但在CD8+ T细胞活化后，Tph1的表达显著增加（见图S4A-S4B）。此外，mRNA表达谱还显示，单胺转运体Slc6a4（编码血清素转运体SERT）在CD8+ T细胞中高度表达，而Slc6a2（去甲肾上腺素转运体）和Slc6a3（多巴胺转运体）的表达则相对较低（见图S4C和S4D）。这些结果表明，CD8+ T细胞中的5-HT可能来源于TPH1的内源性合成以及通过SERT的外源性吸收。

流式细胞术和ELISA分析进一步证实，与活化的野生型（WT）CD8+ T细胞相比，Tph1-/-的CD8+ T细胞中5-HT水平无法积累，同时细胞增殖和IFN-γ的产生也显著降低（见图4A-C）。类似地，与Slc6a4fl/fl CD8+ T细胞相比，SERT缺陷的Slc6a4fl/fl CD8-Cre T细胞无法有效吸收5-HT，进而抑制了细胞增殖和IFN-γ的产生（见图4D-F）。

考虑到肿瘤微环境富含5-HT，主要由肿瘤细胞和血小板分泌，我们进一步研究了SERT在介导CD8+ T细胞摄取5-HT并增强抗肿瘤免疫活性中的作用。结果显示，在SERT缺陷的Slc6a4fl/fl CD8-Cre小鼠中，肿瘤生长速度更快，同时CD8+ T细胞的浸润减少，细胞内IFN-γ的表达也降低（见图4J-K）。这些发现有力地证明了细胞内5-HT的积累对于增强CD8+ T细胞的抗肿瘤反应至关重要。

五、5-HT诱导的GAPDH 5-HT化修饰延长CD8+ T细胞活化时间的机制

在之前的研究结果中，我们观察到TGM2缺陷和SERT缺陷的CD8+ T细胞对5-HT刺激仍保留部分反应，这提示我们5-羟色胺受体（5-HTRs）可能也参与了这一过程。5-HTRs是一个包含7个家族和至少15种不同受体的庞大体系。通过筛选RNA-seq结果中5-HTRs的表达情况，我们发现大多数HTRs在未激活或激活的CD8+ T细胞中几乎无法检测到，仅有Htr1b和Htr7的表达较为显著（见图5A）。流式细胞术进一步验证了在CD8+ T细胞中，HTR1B的表达上调，而HTR7的表达则下调（见图5B）。

功能实验显示，虽然HTR7激动剂能够促进CD8+ T细胞的活化，但其效果并不如5-HT那么明显（见图5C）。而HTR7拮抗剂则能部分逆转5-HT诱导的CD8+ T细胞激活（见图5D）。值得注意的是，在aCD3/aCD28刺激过程中，Htr7的表达呈现下降趋势（见图5E）。

作为G蛋白偶联受体的一员，HTR7通过Ca²⁺作为第二信使传递信号。我们发现，HTR7激动剂能够诱导Ca²⁺浓度的升高，但这一效应会随着时间的延长而逐渐减弱（见图5G）。类似地，HTR7激动剂还能促进糖酵解相关基因Hk2和Pkm的表达，但这些基因的表达水平也会随着时间的延长而逐渐降低（见图5H-I）。然而，对于细胞内IFN-γ的产生来说，尽管其变化趋势与糖酵解基因相似，但5-HT仍能在较长时间内维持对CD8+ T细胞激活的促进作用（见图5J）。与此同时，GAPDH的5-HT化修饰水平也显著上调（见图5K）。

这些结果表明，5-HT可能通过诱导GAPDH的5-HT化修饰，从而延长了CD8+ T细胞的活化时间。尽管HTR7在这一过程中发挥了一定的作用，但其具体机制仍需进一步深入研究。

六、MAOA通过降解细胞内5-HT并抑制GAPDH的5-HT化修饰来调控CD8+ T细胞的抗肿瘤活性

单胺氧化酶（MAO）作为5-羟色胺（5-HT）降解的关键酶类，在调节细胞内5-HT水平中发挥着至关重要的作用。已知在CD8+ T细胞中，主要表达的是MAOA亚型。本研究发现，敲除MAOA能够显著升高细胞内的5-HT水平以及GAPDH的活性（见图6A-C）。同时，MAOA的敲除还促进了GAPDH向胞质的定位（见图6D-E）。

在体外和体内实验中，我们观察到MAOA敲除的CD8+ T细胞表现出更强的活化能力和抗肿瘤活性（见图6F-G）。进一步的研究显示，这种效应与GAPDH的5-HT化修饰增强密切相关（见图6H）。为了验证这些发现，我们在小鼠模型中进行了类似的实验，并得到了相一致的结果（见图6I-J）。

综上所述，我们的研究表明MAOA通过降解细胞内的5-HT，进而抑制GAPDH的5-HT化修饰，从而调控CD8+ T细胞的抗肿瘤活性。这一发现为理解5-HT在免疫调节中的作用提供了新的视角，并可能为肿瘤免疫治疗提供新的策略。

七、CAR-T细胞中过表达TPH1促进5-HT生成以增强抗肿瘤免疫效果

为了深入探索CD8+ T细胞5-HT化修饰在肿瘤免疫治疗中的潜在应用价值，我们研究了这一修饰在嵌合抗原受体（CAR）T细胞抗肿瘤功效中的作用。具体而言，我们利用靶向人类表皮生长因子受体变体III（EGFRvIII）的CAR转导T细胞，并巧妙地插入了编码5-羟色胺合成酶TPH1的基因盒（见图7A）。

实验结果显示，TPH1过表达的CAR-T细胞（即TPH1-CAR-T细胞）能够显著升高细胞内的5-HT水平（见图7B）。这一变化进一步促进了GAPDH Q262ser的表达上调（见图7C），这暗示了5-HT化修饰可能得到了增强。更为重要的是，TPH1-CAR-T细胞展现出了增强的抗肿瘤免疫活性（见图7E-F），在动物模型中显著抑制了肿瘤的生长（见图7G），并促进了肿瘤细胞的凋亡（见图7H）。

这些发现不仅揭示了5-HT在CAR-T细胞抗肿瘤功能中的重要作用，还为开发新型肿瘤免疫治疗策略提供了有力的实验依据。通过过表达TPH1来提高CAR-T细胞内5-HT水平，可能成为一种有效的手段来增强CAR-T细胞的抗肿瘤效果，为未来的肿瘤免疫治疗开辟新的道路。