文献解析|乳酸盐-乳酸化途径与HSPA6轴协同抑制IFN-β生成，加速PRRSV复制

03  PRRSV诱导的组蛋白乳酸化的潜在下游靶点鉴定

为了深入理解组蛋白乳酸化在PRRSV感染细胞内如何调控基因表达，作者首先采用了抗H3K 18la抗体与RNA测序（RNA-seq）相结合的CUT&Tag技术。CUT&Tag数据的维恩图揭示，在未感染的细胞中检测到570个富集峰，而PRRSV感染的细胞中则检测到2769个富集峰（图3A）。值得注意的是，两组间共有257个峰，而PRRSV感染组独有的峰高达2456个（图3A），这些被认为是PRRSV感染可能激活的、具有H3K 18la特异性修饰的基因。随后，通过整合CUT&Tag与RNA-seq数据，作者确定了11个在PRRSV感染细胞中高度表达的抗H3K 18la-CUT&Tag靶基因（图3A）。

为验证CUT&Tag和RNA-seq的结果，作者选取了4个富集基因（HSPA6、TNFAIP3、JUN、ATF3）进行CUT&Tag-qpcr分析。结果显示，与未感染细胞相比，PRRSV感染细胞中这些基因的DNA片段丰度显著增加（图3B）。其中，HSPA6在RNA-seq数据中尤为突出，是PRRSV感染反应中最显著上调的基因（图3A）。进一步分析发现，PRRSV感染细胞经乳酸处理后，HSPA6 DNA片段富集增加；而经乳酸抑制剂没食子黄素处理后，其富集程度降低（图3B）。因此，作者在后续实验中重点关注了HSPA6。

作者接着检测了HSPA6在乳酸、没食子黄素处理或PRRSV感染细胞中的转录和蛋白表达水平。结果显示，乳酸处理或PRRSV感染均能提高HSPA6的mRNA和蛋白水平，而没食子黄素处理则显著降低其表达（图3C和D）。此外，作者还观察了HSPA6在PRRSV感染细胞中的定位情况。与未感染细胞中HSPA6的分散细胞质分布相比，PRRSV感染后HSPA6在整个细胞质中均有分布，表明PRRSV感染改变了HSPA6的分布模式。

为了更精确地确定HSPA6在PRRSV感染细胞中的亚细胞定位，作者使用了一系列抗体对IPAM细胞进行染色，包括兔抗HSPA6抗体以及针对内质网、高尔基体和线粒体的标记抗体。结果显示，无论在PRRSV感染还是未感染的细胞中，HSPA6均与线粒体共定位，而不与高尔基体或内质网共定位。有趣的是，与未感染细胞相比，PRRSV感染细胞的线粒体HSPA6定位信号增强。在未感染细胞中，HSPA6主要定位于线粒体内腔；而在PRRSV感染后，其定位发生变化，主要定位于线粒体管腔壁。综上所述，这些结果表明HSPA6的线粒体定位是H3K 18la修饰的下游效应之一。

04  HSPA6促进PRRSV增

为了探究HSPA6在PRRSV感染过程中所扮演的角色，作者采取了将HSPA6真核表达构建体导入IPAM细胞，并随后使这些细胞感染PRRSV的策略。实验结果显示，HSPA6的过表达以一种剂量依赖的方式促进了病毒RNA拷贝数的增加、病毒核衣壳（N）蛋白的表达提升以及病毒滴度的上升（图4A）。此外，作者还深入研究了HSPA6基因敲除对PRRSV复制的影响。为此，他们设计了三种专门靶向HSPA6的小干扰RNA（siRNA），并评估了这些siRNA对HSPA6表达的抑制效率。在这些siRNA中，siHSPA6-1和siHSPA6-3展现出了尤为显著的敲低效果（图4B）。随后，作者利用转染了siHSPA6-1或siHSPA6-3的IPAM细胞进行PRRSV感染实验，结果显示，内源性HSPA6的敲低显著降低了病毒的N蛋白水平和病毒滴度（图4C）。综上所述，这些实验结果有力地证明了HSPA6在PRRSV增殖过程中起到了正向调控的作用。

05  HSPA6负调控IFN-β的产生

已知热休克蛋白家族的多个成员，诸如HSP70、HSP27和HSP90，均具备调节干扰素（IFN）产生及其信号传导的功能。鉴于IFN在宿主抵抗病毒感染过程中发挥着核心作用，且PRRSV是一种对IFN敏感的病毒，作者探究了HSPA6是否通过抑制IFN-β的诱导来促进PRRSV的增殖。

为此，作者在HEK293T细胞和IPAM细胞中共同转染了IFN-β-Luc报告质粒、pRLTK质粒以及不同剂量的HSPA6表达构建体或空载体。在转染后24小时，细胞被仙台病毒（SeV）感染或保持未处理状态，随后进行裂解以测定IFN-β启动子驱动的荧光素酶活性。如图5A所示，在两种细胞中，HSPA6的过表达均以剂量依赖的方式显著抑制了SeV诱导的IFN-β启动子激活，提示HSPA6是IFN-β生成的负调控因子。

为进一步验证这一结论，作者采用了稳定表达绿色荧光蛋白的IFN敏感水疱性口炎病毒（VSV-GFP）进行IFN生物测定。结果显示，SeV感染的细胞上清液能够限制VSV-GFP的复制（图5B），但来自过表达HSPA6的细胞的上清液则恢复了VSV-GFP的复制能力（图5B）。此外，实时荧光定量PCR（qRT-PCR）实验表明，HSPA6的过表达显著降低了SeV或PRRSV诱导的内源性IFN-β的转录（图5C），而敲低HSPA6则增强了HEK293T和IPAM细胞中SeV或PRRSV诱导的IFN-β基因转录（图5D）。这些数据均支持HSPA6负调控IFN-β诱导的结论。

已知乳酸诱导的乳酸化可以激活HSPA6（图3），但HSPA6是否以乳酸依赖的方式抑制IFN-β诱导尚不清楚。因此，作者首先研究了乳酸对IFN-β诱导的影响。感染PRRSV的IPAM细胞被乳酸或乳酸抑制剂没食子黄素处理。在孵育24小时后，作者分析了乳酸对PRRSV感染期间IFN-β诱导的影响。结果显示，乳酸以剂量依赖的方式降低了PRRSV感染后IFN-β的mRNA水平（图5E），而没食子黄素则以剂量依赖的方式增加了IFN-β的mRNA表达（图5E）。

接下来，作者测试了IFN-β在添加乳酸和/或HSPA6敲低的细胞中的诱导情况。当用乳酸处理HSPA6敲低的细胞时，乳酸对IFN-β的抑制作用减弱（图5F），这表明HSPA6通过乳酸-乳酸化轴负调控IFN-β的诱导。

06  HSPA6抑制转录因子IRF3和NF-κB的激活

干扰素调节因子3（IRF3）和核因子κB（NF-κB）是触发IFN-β产生的关键转录调控因子。为了深入探究HSPA6是否通过削弱SeV或PRRSV诱导的IRF3和NF-κB激活来减少IFN-β的生成，作者设计了一项实验：在HEK293T和IPAM细胞中，将荧光素酶报告质粒IRF3-luc或NF-κB-luc与pRL-TK质粒以及不同剂量的HSPA6表达构建体或空载体进行共转染。24小时后，细胞被SeV或PRRSV感染12小时。如图6A和B所示，与对照组相比，在两种细胞中，HSPA6以剂量依赖的方式显著抑制了SeV或PRRSV诱导的IRF3和NF-κB激活。

众所周知，IRF3和NF-κB在进入细胞核并激活IFN-β转录之前，需要经过磷酸化激活的步骤。因此，作者进一步探究了HSPA6对IRF3和NF-κB的p65亚基磷酸化水平以及核易位的影响。不出所料，HSPA6的过表达降低了SeV和PRRSV感染后IRF3和p65的磷酸化水平（图6C）。与Western blot结果相吻合的是，SeV诱导的IRF3和p65核易位也被HSPA6所阻断（图6D）。

接下来，作者又检测了乳酸和没食子黄素对PRRSV感染期间IRF3和NF-κB激活的影响。结果显示，乳酸处理后，PRRSV诱导的IRF3和NF-κB活性受损；相反，与对照组相比，没食子黄素治疗后，PRRSV诱导的IRF3和NF-κB激活得到增强。

综上所述，这些实验结果清晰地表明，HSPA6通过抑制IRF3和NF-κB的激活来对抗IFN-β的诱导。