【罗公流式秘籍20】流式做磷酸化的优点和要点小结

同学X：罗工，老板要我研究CD4+T细胞体外刺激诱导后里面各种细胞亚型的Stat家族的蛋白磷酸化水平变化，您说这要是做起WB实验，我给分选多少CD4+T细胞才够啊

罗工：这种课题还做啥WB啊，费时费力又费钱，直接用流式Phosflow检测啊，轻松搞定

同学X：流式Phosflow是什么啊？

罗工：就是用流式检测蛋白磷酸化水平的技术，跟常规流式检测一样，买对应磷酸化抗体进行流式染色就行了

罗工：

罗工：您这实验，照着这个高分文献里的结果图搬就可以了

同学X：w(ﾟДﾟ)w，高大尚啊，快给我好好说说，我好找老师汇报去

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流式Phosflow 技术是细胞信号研究上的革命性进步，相较传统的Western blotting检测，优点也是非常显著的：

流式的多参数检测属性，决定流式Phosflow 技术可同时分析多种胞内磷酸化蛋白、细胞因子和细胞表面标记分子，进而得到各个群体细胞中信号转导的多种信息，将分离和分析一步完成，可以研究复杂的混合细胞。研究者可以在接近自然条件下监测细胞刺激因素的作用，减少在体外分析时的时间因素等导致的差异。甚至稀少的细胞亚群，也可以在单个实验中鉴定和分析。如下文献中的典型案例图，供大家在科研设计及结果展示时作为参考：



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流式磷酸化染色流程也并不复杂，与常规胞内流式染色基本无异，如下为样本孵育制备步骤和实验要点：
1.进行细胞计数，保证每个样本细胞数为1~5*10的7次方，进行个人必要的刺激/实验干预处理（如没有此设计则只计数）；
2.将fix buffer放入37度水浴锅复温备用；
3.将 Prem buffer放入-20度冰箱备用；
4.将细胞重悬于100ul PBS中，加入500ul 预热的fix buffer，迅速震荡混匀后置于37度水浴锅中孵育10分钟。350g 10分钟离心弃去上清；
5.加入2ml PBS 350g离心 5分钟后弃去上清（尽量弃干净）； 
6.涡旋振荡沉底细胞，边振荡边缓慢加入Perm buffer 1ml，之后放在冰上孵育30分钟，350g 5分钟离心弃去上清；
7.加入5-10ml pbs重悬细胞，350g 10分钟 离心去上清，此步骤重复2次为佳；
8.100ul pbs重悬细胞，加入所有流式抗体（注意剂量，BD抗体5ul，其他抗体按推进来）后涡旋混匀，室温孵育50分钟；
9.孵育完成后加入1ml pbs 250g 5分钟离心，重悬于200-300ul pbs中等待上机。
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流式Phosflow技术常用产品推荐
 

评估蛋白磷酸化往往是细胞生物学家研究保留曲目中必不可少的一部分，可了解调节和控制蛋白质活力和功能的机制。每种磷酸化检测技术在不同的背景下发挥优势，因此必须精心挑选最适合实验设计的方法。本文着重介绍了流式在蛋白磷酸化检测中的应用，愿本文可为各位科研研究工作者提供有价值的参考。